李梦岚 谭琴 徐秀
1武汉市中心医院内分泌科 430000; 2华中科技大学同济医学院附属同济医院肾内科，武汉 430000
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是由糖尿病引起的肾脏微血管病变。研究发现，足细胞损伤是DN的主要发病机制，主要包括足细胞肥大、上皮-间充质转化(EMT)、足细胞脱落和凋亡等。肾病蛋白(nephrin)是足细胞成熟的标志性分子，具有维持足细胞完整和肾小球滤过功能的作用。研究表明，在各种蛋白尿性肾脏疾病以及肾小球疾病的动物模型中，肾病蛋白的表达降低，且肾病蛋白的低表达与足细胞损伤及肾脏疾病的进展有关。微小RNA(microRNA，miRNA)作为小分子非编码RNA可通过抑制或降解靶基因mRNA，参与生物体的多种生理及病理过程。在DN患者的肾组织中可见特异性miRNA的表达，其在一定程度上可反映患者病情的改变。最近研究表明，miRNA-192在肾脏病理生理过程中起关键作用，miRNA-192的表达与DN有关。Wilms肿瘤蛋白1(WT1)是Wilms瘤抑癌基因，在肾组织中特异性表达于足细胞，是足细胞的标志蛋白。本实验通过高糖诱导足细胞并检测miRNA-192及WT1的表达水平，探讨二者在高糖诱导足细胞损伤中的作用机制，为临床治疗DN提供依据。
1.1 材料
1.1.1 实验主要试剂 人肾小球足细胞(human podocyte cell，HPC)、葡萄糖(均购自美国Sigma公司)、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)、Lipofectamine 2000[购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司]、miRNA-192抑制剂及其阴性对照(均购自上海吉玛生物科技公司)、Trizol、miRNA-192、U6引物(Invitrogen公司)、WT1、转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、GAPDH普通PCR上下游引物(上海生工公司)、WT1兔单克隆抗体(ab224806)、肾病蛋白兔单克隆抗体(ab227806)、TGF-β1小鼠单克隆抗体(ab190503)、α-SMA兔单克隆抗体(ab32575)、β-actin兔单克隆抗体(ab179467，美国Abcam公司)、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(购自美国LI-COR公司)。
1.1.2 细胞培养及分组 足细胞复苏后在含10%胎牛血清及5.5 mmo1/L葡萄糖的RPMI 1640培养基中，于33℃、5% CO培养箱培养，每2 d换1次液，待细胞生长至细胞融合80%时用含0.05%胰蛋白酶的消化液进行消化传代，然后转入37℃、5% CO培养箱分化14 d。选取在37℃条件下分化为树枝状的HPC为研究对象，并将细胞分为4组：A组为空白对照组：细胞正常培养(5.5 mmo1/L葡萄糖)，不做处理；
B组为高糖组：在细胞中加入30 mmol/L葡萄糖；
C组为阴性对照组：在细胞中转染终浓度为50 nmol/L的miRNA NC，转染6 h后加入30 mmol/L葡萄糖进行培养；
D组为miRNA-192抑制组：在细胞中转染终浓度为50 nmol/L的miRNA-192 Inhibitor，转染6 h后加入30 mmol/L葡萄糖进行培养。细胞处理后继续培养48 h进行后续实验。
1.2 观察指标
1.2.1 采用Western印迹检测各组足细胞表面标志蛋白肾病蛋白、WT1、TGF-β1、α-SMA的蛋白表达水平 收集各组对数生长期细胞提取总蛋白，取40 μg与上样缓冲液混合，100℃加热5 min后通过10% SDS-PAGE电泳分离，90 V电压转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，洗膜后加入肾病蛋白、WT1、TGF-β1、α-SMA一抗4℃过夜，以辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，用化学发光法显色，凝胶成像系统拍照。以β-actin为内参，每组实验重复3次。
1.2.2 qRT-PCR检测各组细胞miRNA-192、WT1、TGF-β1、α-SMA mRNA表达水平 取各组细胞分别加入1 ml Trizol，混合均匀后冰上裂解5 min，12 000 g离心15 min；
取上清加入200 μl氯仿，充分混匀后冰上静置10 min，12 000 g离心10 min；
弃上清，加入75%乙醇7 500 g离心5 min，室温晾干，加入DEPC水溶解。按照逆转录试剂盒将总RNA逆转成cDNA，取1 μl cDNA作为模板进行qRT-PCR扩增。反应条件：预变性95℃ 5 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环后72℃延伸10 min。每个样本重复检测3次。miRNA-192上游引物：5′-CGCGGCTGACCTATGAATTG-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；
U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。每组基因的相对表达量按公式(2法)计算。引物设计见表1。
表1 qRT-PCR检测各基因引物序列
1.2.3 miRNA-192与WT1基因的靶向关系 采用双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-192与WT1基因的靶向关系。本实验通过分别扩增出含miRNA-192结合位点的WT1 3′UTR序列(tcTTGTCTAACATTCCCGAGGTCAg)及miRNA-192结合位点突变的WT1 3′UTR序列(tcTTTTCTAACAGTCCCGGTTCCAg)，将其插入到荧光素酶报告基因载体(psiCHECK2)上，构建野生型WT1-Wt和突变型WT1-Mut重组质粒。根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染，按照1 μg重组质粒，2 μl Lipofectamine 2000比例稀释后，将其与Lipofectamine 2000混合液分别与miRNA-192抑制剂及阴性对照共转染至足细胞中，置于37℃培养箱继续培养6 h后更换为新鲜的、含有10%胎牛血清的培养基中培养48 h，收集并裂解细胞，12 000 g离心5 min，取上清用于测定，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测荧光素酶活性。
2.1 各组细胞肾病蛋白的蛋白表达水平 与A组相比，B组和C组肾病蛋白的蛋白表达水平显著降低(=444.404，<0.05)；
与C组相比，D组肾病蛋白的蛋白表达水平升高(=16.519，<0.05)，见图1。
2.2 各组细胞miRNA-192的相对表达量 与A组相比，B组和C组miRNA-192相对表达量显著升高(=184.216，<0.05)；
与C组相比，D组miRNA-192相对表达量降低(=10.533，<0.05)，见图2。
2.3 各组细胞WT1蛋白及mRNA的表达水平 与A组相比，B组和C组WT1蛋白及mRNA表达水平均显著降低(=243.543，<0.05；
=107.898，<0.05)；
与C组相比，D组WT1蛋白及mRNA表达水平升高(=17.088，<0.05；
=8.186，<0.05)，见图3。
2.4 miRNA-192与WT1基因的靶向关系验证 双荧光素酶报告基因实验分析结果显示，miRNA-192与WT1基因3′-UTR存在互补结合位点，miRNA-192与WT1能够靶向结合。荧光素酶活性检测结果显示，抑制miRNA-192后可明显促进荧光素酶活性；
而将WT1的3′-UTR突变后，荧光素酶活性无变化，见图4。
2.5 各组细胞TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA表达水平 与A组相比，B组、C组TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA表达水平均显著升高(=69.014，<0.05；
=87.644，<0.05；
=147.714，<0.05；
=247.584，<0.05)；
与C组相比，D组TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA蛋白表达水平均降低(=6.114，<0.05；
=7.941，<0.05；
=8.239，<0.05；
=8.481，<0.05)，见图5。
DN是造成终末期肾功能衰竭最普遍的原因，也是主要的糖尿病微血管并发症之一，是全世界肾脏病患者发病和死亡的主要原因。足细胞是一种高度分化的肾小球上皮细胞，其形态及功能异常是DN白蛋白尿产生及肾小球纤维化的重要原因之一。研究表明，miRNA在DN的发生、发展过程中发挥重要作用。miRNA-192是在肾脏组织中尤其是系膜细胞中特异性表达的miRNA，可调控系膜细胞的增殖和凋亡并促进肾纤维化，与DN的发生、发展密切相关。陈月英等研究发现，miRNA-192水平在DN患者尿液中表达显著升高，且与肾功能损伤程度相关。动物实验研究发现，糖尿病小鼠肾皮质中miRNA-192的表达增加，用体内缺乏miRNA-192基因的小鼠建立糖尿病模型后，肾组织纤维化及肥大程度减轻，白蛋白尿排泄率下降。本研究采用高糖诱导足细胞，结果发现，与A组相比，B组和C组肾病蛋白的蛋白表达水平显著降低，而miRNA-192相对表达量升高；
与C组相比，D组肾病蛋白的蛋白表达水平升高、miRNA-192相对表达量降低。提示高糖可导致足细胞miRNA-192表达水平升高，足细胞功能损伤；
抑制miRNA-192表达后可减轻足细胞损伤。
miRNAs是一类可对基因表达进行转录后调控的分子，其可通过下游靶点对机体生长、发育、分化及凋亡等生理过程的调控起重要作用。WT1是一种转录因子，参与足细胞分化并维持足细胞的功能，其在成熟足细胞中高度表达，研究发现，肾小球硬化小鼠的成熟足细胞中WT1基因表达显著降低。高原等研究发现，IgA肾病患者肾组织WT1表达降低，促进肾小管上皮细胞转分化，加重肾间质纤维化。本研究结果发现，高糖诱导足细胞中WT1基因表达降低，与C组相比，D组WT1蛋白表达水平及mRNA表达水平升高；
进一步对miRNA-192与WT1基因的靶向关系进行验证，结果发现，miRNA-192与WT1基因3′-UTR存在互补结合位点，miRNA-192与WT1能够靶向结合。提示miRNA-192可能通过靶向调控WT1，在高糖诱导足细胞损伤中发挥重要作用。
研究发现，损伤的肾小管上皮细胞诱导成纤维细胞和肌成纤维细胞积累，并通过EMT最终导致小管间质纤维化和慢性肾脏疾病的进展。DN时足细胞转分化仅有EMT相关表型蛋白的表达变化，主要表现为上皮表型蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白1、肾病蛋白等表达逐渐缺失，同时间质表型蛋白基质金属蛋白酶-9、TGF-β1及α-SMA等表达增加。在DN小鼠模型中发现，肾小球miRNA-192的表达增加与TGF-β活性增强有关，对肾脏miRNA-192的特异性抑制作用可降低肾组织纤维化并抑制白蛋白尿反应。本研究结果发现，与A组相比，B组和C组TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA表达水平均显著升高；
与C组相比，D组TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA蛋白表达水平均降低，提示高糖诱导足细胞发生EMT，促进DN的发展；
抑制miRNA-192的表达可减轻高糖诱导的足细胞EMT。
综上所述，高糖诱导的足细胞miRNA-192表达升高并靶向调控WT1促进DN的发展，其作用机制可能与足细胞EMT有关；
抑制miRNA-192的表达可减轻高糖诱导的足细胞EMT，为今后DN的预防和治疗提供新思路。但miRNA-192是否通过靶向WT1促进足细胞EMT，有待进一步研究。
