石国西，翟俊英，钮红丽，刘波
（1.南阳市第一人民医院 生殖医学科，河南 南阳 473000；
2.河南省人民医院 生殖医学科，河南 郑州 475000 ）
早期流产是指胎儿体重不足1 000 g、孕周不足28 周，胎儿等附属物从母体脱离，妊娠过程自然终止，大部分自然妊娠流产均发生与妊娠12 周之前［1］。目前，临床普遍认为诱发自然流产的原因有免疫功能异常、环境因素、母体因素、胚胎因素等，将近50%的自然妊娠流产与染色体异常有关［2-3］。近年来，随着辅助生殖技术（ART）的发展，虽然给诸多不孕症患者带来了福音，但由于ART 造成的染色体异常妊娠流产率明显增高，现已引起临床高度重视［4］。低深度全基因组测序技术（CNV-seq）具有基因组覆盖率高、准确性高、分辨率高等优点，可分析染色体有无畸变，帮助医生判断妊娠流产的遗传学病因［5-6］。基于此，为探究CNV-seq 在ART 妊娠流产胚胎染色体异常中的临床价值，本文选定南阳市第一人民医院2020 年6 月至2022 年6 月接诊的98 例ART 妊娠流产患者研究，报告如下。
1.1 一般资料
选定南阳市第一人民医院2020 年6 月至2022年6 月接诊的98 例ART 妊娠流产患者，年龄23～40 岁，平均（31.52±3.04）岁；
孕周5～25 周，平均（15.62±1.64）周；
孕次1～5 次，平均（3.16±1.34）次；
流产次数0～4 次，平均（2.06±0.76）次；
体重指 数（BMI）21～27 kg/m2，平 均（23.72±1.11）kg/m2。研究经南阳市第一人民医院伦理委员会审批。
纳入标准：①均经B 超检查：确认胚胎停育。②年龄20～40 周岁。③神志清楚，可配合医生完成本研究。排除标准：①合并狂躁症等精神系统疾病者。②同期参与其他研究者。③存在妊娠期感染以及有害物质接触史者。
1.2 方法
CNV-seq 检测方法：①准备样本：采集所有患者流产物（胚胎组织或绒毛）100 mg，以0.9%的氯化钠溶液清洗干净，置于无菌采样管中，放置在-20℃的冰箱保存，采用QIAamp DNeasy Blood&Tissue Kit 提取流产物中的DNA，所提取DNA的浓度必须在20 ng/μL 以上，总量在500 ng 以上。②检查方法：用超声波进行末端修复，加入接头、A 尾、引物PCR，构建DAN 文库，采用QF-PCR以及Agilent 定量质控文库，以Nextseq550AR 测序平台测序，每一个测序标签应匹配对应的染色体，分析标准化Z值，判定染色体异常情况。③染色体G 显带核型检查：抽取羊水20 mL，进行细胞接种，每一个孕妇的样本，均展开两线培养，培养7 d 左右，在显微镜下观察细胞形态，再次换液培养，培养1～2 d 展开细胞收获、染色制片以及核型分析。④质量控制：本次研究所有受检者的流产物均由同2 名医生完成检测、结果判定，对于存在异议的地方，应再次讨论或者介入第3 名医生参与诊断，确定最终诊断结果。
1.3 观察指标
统计染色体异常率、异常染色体分布情况，分析孕妇既往流产次数、孕周、年龄与染色体异常发生率的关系，比较既往自然流产次数≥3 次者、＜3 次者染色体异常率，比较孕周≥12 周、＜12 周者染色体异常率，比较孕妇年龄≥35 岁、＜35 岁者染色体异常率。
1.4 统计学方法
数据处理选择SPSS 26.0 软件，计量资料正态分布t检验，以均数±标准差（）表示；
计数资料χ2检验，以百分率（%）表示。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 CNV-seq 检查结果与核型检查结果比较
98 例患者共检出染色体异常70 例，染色体异常率为71.43%，以常染色体重排或缺失、45,X 染色体异常最为常见，异常率为14.29%。CNV-seq检查结果与核型检查结果仅有5 例不一致，其余检查结果均一致。见表1。
2.2 自然流产次数≥3 次、＜3 次染色体异常发生率比较
染色体异常发生率自然流产次数≥3 次者高于自然流产次数＜3 次者，差异有统计学意义（χ2=4.247,P=0.039）。见表2。
表2 自然流产次数≥3 次、＜3 次染色体异常发生率比较［n(%)］
2.3 孕周≥12 周、＜12 周染色体异常发生率比较
孕周≥12 周者染色体异常发生率低于孕周＜12周者，差异有统计学意义（χ2=7.350,P=0.007）。见表3。
表3 孕周≥12 周、＜12 周染色体异常发生率比较［n(%)］
2.4 年龄≥35 岁、＜35 岁染色体异常发生率比较
染色体异常发生率年龄≥35 岁者高于年龄＜35岁者，差异有统计学意义（χ2=4.059,P=0.044）。见表4。
表4 年龄≥35 岁、＜35 岁染色体异常发生率比较［n(%)］
2.5 随访结果
对CNV-seq 检查结果与核型检查结果不一致的患者进行随访，其中2 例足月分娩，胎儿未见明显异常。2 例足月分娩，胎儿出生后存在心脏异常，1 例低比例嵌合。
近年来，随着人们生活压力增大，性观念改变，由于不孕症而接受ART 的人群明显增多，从而导致ART 妊娠流产率显著增高［7］。妊娠流产作为一种妊娠病理性疾病，会对孕妇的生命安全、身体健康构成一定威胁［8］。临床有研究［9］表明：染色体异常是引发自然流产、不良妊娠结局的重要原因之一。既往临床检测染色体异常的金标准是核型分析检测技术，该技术对采集样品的处理要求较高，检测过程繁琐复杂，且样品培养需要耗费较长时间，培养失败率较高，并未在临床中广泛推广开来［10］。故寻求一种操作简单、灵敏度高的检测技术，分析ART 妊娠流产患者染色体异常情况及分布，成为目前临床高度关注的内容。
CNV-seq 检测能力较强，可以在同一平台同时检测上万个测序技术，与生物学信息相结合，一次性检测23 对染色体，及早发现染色体重排或者缺失等情况，CNV-seq 对检测样品的要求较低，可重复检查，弥补了传统检测技术的不足［11-12］。通过CNV-seq 检测，可及早发现染色体异常，如果未发现染色体畸变，则可以将染色体畸变的影响排除，考虑妊娠流产是否与感染、免疫、精子异常等有关［13］。如果CNV-seq 检测中染色体畸变是重复或者缺失，则需要进一步分析妊娠流产的染色体异常是家族遗传或者新发变异，必要时夫妻双方均要做CNV-seq 检测，评估SNT 多态性对妊娠流产的影响。本研究显示：98 例患者染色体异常率为71.43%，以常染色体重排或缺失、45,X 染色体异常最为常见，异常率为14.29%。提示ART妊娠流产的染色体异常率较高，与既往报道［14］的ART 妊娠流产染色体异常率在50% 以上接近。CNV-seq 检测技术具有无需细胞培养、操作方便等优点，临床可考虑将其作为染色体异常筛查的主要方法。但CNV-seq 技术也存在一定不足，例如碱基缺失或插入、无法检出低水平点变异、嵌合体、不能检出平衡倒位及异位等。本研究显示：CNV-seq 检查结果与核型检查结果仅有5 例不一致，其余检查结果均一致。由此可见，对ART 患者及早进行产前诊断至关重要，通过CNV-seq 技术检查，可提高对部分染色体微重复、微缺失的检出率，染色体微重复、微缺失容易引发内脏器官畸形、智力发育迟缓、生长发育异常等复杂临床表型，通过CNV-seq 技术检查，可最大限度的提高染色体异常检出率。
本研究显示：染色体异常发生率自然流产次数≥3 次者（90.00%）高于自然流产次数＜3 次者（66.67%），差异有统计学意义。表明染色体异常多见于自然妊娠流产次数多的女性。故目前临床对于上一次存在不良孕产史或自然流产史的女性，下一次妊娠时在孕早期或孕中期应及时进行产前诊断，判断胎儿染色体核型是否正常，如果正常，即可保留此胎，如果不正常，则需要及时与胎儿父母取得联系，征求胎儿父母的意见，决定是否保留胎儿。本研究显示：孕周≥12 周者染色体异常发生率（57.14%）低于孕周＜12 周者（82.14%）（P＜0.05）。表明ART 自然流产染色体异常多发生于妊娠12 周之内。
本研究显示：染色体异常发生率年龄≥35 岁者（82.50%）高于年龄＜35 岁者（63.79%），差异有统计学意义。表明孕妇妊娠年龄在35 周岁以上，更容易出现染色体异常。分析如下：母体年龄对妊娠结局的影响是非常大的，临床有研究表明：母体妊娠时的年龄与非整倍体子代发生率呈正相关性［15］。主要是由于首次减数分裂处于S1 期的卵母细胞在机体停留时间越长，减数分裂S2 期发生异常以及卵细胞异常率就越高［16-17］。故临床将高龄作为ART 妊娠流产的危险因素。女性随着年龄的增长，卵巢功能也会逐渐减退，对同对染色体间相互关系造成不良影响。另外，年龄大的女性，卵巢功能老化，黄体酮、雌激素含量均降低，从而造成卵泡纺锤体老化，有丝分裂染色体碱基对分离不完全或者不分离，进而增加三体发生率［18］。在张哲慧等［19］研究中，通过Logistic 回归分析，年龄是胚胎染色体异常的危险因素（P=0.002,95%CI：1.038～1.179），接近本研究结果。
综上所述：ART 妊娠流产在孕早期的发生率较高，通过CNV-seq 技术，可提高染色体异常检出率，年龄≥35 周岁、既往自然流产次数≥2 次的ART 患者更容易出现染色体异常，临床应加强对此类人群的关注，及早评估其自然流产风险，及早给予针对性处理，最大限度改善妊娠结局。
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