张荣花,张亚楠,韩向阳,崔笑妍,田晓丽,章广玲,刘志勇
肝纤维化是一种病理性修复反应,针对肝脏损伤所产生,其主要特征是肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积,慢性肝损伤可发展为肝硬化,最终发展为肝癌[1]。越来越多的miRNAs参与到HSCs的增殖、上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)、炎症和凋亡等生物学功能,调控肝纤维化。丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase,AKT)是由AKT1、AKT2和AKT3组成的蛋白激酶家族的创始成员,又称蛋白激酶B(protein kinase B,PKB),调节不同的细胞功能,并在许多癌症中发挥重要作用[2],miR-433通过下调靶基因AKT3抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖[3]。课题组前期研究[4]显示miR-22-3p和miR-29a-3p在胆总管结扎诱导的胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝脏和活化的肝星状细胞LX-2中低表达,但是AKT3作为miR-22-3p和miR-29a-3p的功能靶基因以及AKT3在肝纤维化发生发展过程中的具体机制仍未被完全阐明。该研究探讨过表达AKT3能否逆转miR-22-3p和miR-29a-3p对LX-2细胞活化的协同抑制作用。
1.1 主要试剂与仪器
1.1.1主要试剂 人肝星状细胞LX-2购自武汉普诺赛生物有限公司;DMEM高糖培养基购自北京EallBio公司;TRIzol、LipofectamineTM2000、三氯甲烷购自美国Thermo公司;反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司;新快速SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自庄盟生物有限公司;AKT3兔单克隆抗体购自美国Affinity公司;CCK-8试剂盒、结晶紫染液、双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;Transwell小室购自美国康宁公司;miRNA mimics/NC购自天津中实同创有限公司;pcDNA3.1、pcDNA3.1-AKT3购自通用生物(安徽)股份有限公司。
1.1.2主要仪器 CO2培养箱(型号:BPN-80CH)购自上海一恒科学仪器有限公司,生物安全柜(型号:AC2-4S1)购自艺斯高(上海)贸易有限公司;垂直电泳槽(型号:JY-SCZ2+)购自北京君意东方电泳设备有限公司,电泳仪电源(型号:DYY-6C)、转印电泳系统(型号:DYY-TC-DYCP-40D)购自北京六一科技有限公司,核酸蛋白检测仪(型号:Nanodrop 2000)、实时荧光定量PCR仪(型号:StepOnePlusABI)购自美国Thermo公司;倒置荧光显微镜(型号:CKX53)购自日本Olympus公司。
1.2 生物信息学分析利用TargetScan、Starbase、miRDB和DIANA数据库预测miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因,并用TargetScan预测两个miRNAs与靶基因的结合位点,RNAhybrid分析计算miRNAs和靶基因的结合自由能。将获得的共同靶基因在仙桃学术网站上进行基因本体(gene ontology,GO)功能与京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia genes and genomes,KEGG)信号通路分析。
1.3 细胞培养与转染LX-2细胞培养于含10% 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1%青链霉素混合液的DMEM高糖培养基中,培养环境为37 ℃、5%CO2。用LipofectamineTM2000试剂将mimics NC、miR-22-3p mimics、miR-29a-3p mimics、miR-22-3p+miR-29a-3p mimics、pcDNA3.1空载质粒、pcDNA3.1-AKT3过表达质粒分别或共同转染LX-2细胞,转染24 h后进行后续实验。
1.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验使用TRIzol试剂提取细胞的总RNA,利用反转录试剂盒逆转录为cDNA,qRT-PCR检测目的基因的表达水平,反应条件为95 ℃、30 s,循环数为1;95 ℃、5 s,60 ℃、34 s,循环数为40。采用2-ΔΔCt的方法计算基因的相对表达量,GAPDH作为α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型胶原α1链(type I collagen α1 chain,COL1A1)和AKT3表达的内参,U6作为miR-22-3p 和miR-29a-3p表达的内参,引物序列见表1。
表1 引物序列
1.5 双萤光素酶报告实验共转染实验分组如下:质粒1+mimics NC、质粒1+miR-22-3p mimics、质粒1+miR-29a-3p mimics、质粒2+mimics NC、质粒2+miR-22-3p mimics、质粒2+miR-29a-3p mimics、质粒3+mimics NC、质粒3+miR-22-3p mimics、质粒3+miR-29a-3p mimics、质粒4+mimics NC、质粒4+miR-22-3p mimics、质粒4+miR-29a-3p mimics。24孔细胞培养板中每孔质粒转染量为200 ng,miR-22-3p/miR-29a-3p mimics或mimics NC转染终浓度为40 nmol/L,每组3个复孔。转染48 h后按照双萤光素酶报告基因检测试剂盒说明书裂解细胞,加入200 μl裂解液裂解后,12 000 r/min离心5 min,每孔取上清液20 μl,加入到避光的96孔板中。然后加入100 μl萤火虫萤光素酶试剂,测定萤光强度(relative light unit,RLU),再加入100 μl海肾萤光素酶试剂,测定RLU,计算二者比值。
1.6 Western blot实验细胞用RIPA裂解液裂解后用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定,然后用SDS-PAGE进行电泳,湿转法将蛋白转至PVDF膜上,接着用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。一抗(AKT3,ab 2839860,1 ∶3 000;GAPDH,ab 9485,1 ∶5 000)4 ℃孵育过夜后,TBST洗膜4次,每次10 min;二抗(ab 6721,1 ∶5 000)室温摇床孵育2 h,TBST洗膜4次。最后经显影仪成像并使用Image J软件识别条带灰度进行分析。
1.7 CCK-8实验实验分组为:mimics NC+pcDNA3.1组、miR-22-3p mimics+pcDNA3.1组、miR-29a-3p mimics+pcDNA3.1组、miR-22-3p+miR-29a-3p mimics+pcDNA3.1组、mimics NC+pcDNA3.1-AKT3组、miR-22-3p mimics+pcDNA3.1-AKT3组、miR-29a-3p mimics+pcDNA3.1-AKT3组、miR-22-3p+miR-29a-3p mimics+pcDNA3.1-AKT3组。将miRNAs mimics和pcDNA3.1-AKT3质粒共转染LX-2细胞,使每孔miRNAs mimics或NC的终浓度是50 nmol/L,每孔质粒总质量是2 μg。各组转染24 h后细胞用胰酶消化后接种至96孔细胞培养板,每孔2 000个细胞。在培养24、48、72、96 h时,分别向各孔中加入10 μl CCK-8试剂和100 μl无双抗培养基的混合液,孵育2 h后在450 nm波长条件下测定细胞的吸光度值,实验独立重复3次,计算不同培养时间各组光密度(optical density,OD)值的平均值和标准差。
1.8 Transwell实验转染后的细胞按5×104个/孔的密度接种于Transwell小室的上室并加入无血清DMEM培养基,下室加入含20% FBS的DMEM培养基。培养24 h后终止培养,弃去上室培养液并用棉签擦净,结晶紫染色10 min后倒置显微镜下观察细胞迁移情况,随机选取视野拍照并用Image J软件计数各组细胞迁移数,将对照组细胞迁移数标准化为1。
1.9 统计学处理应用SPSS 18.0统计学软件对实验数据进行分析,使用GraphPad Prism 8.0软件进行绘图。呈正态分布的数据以平均值±标准差表示,实验独立重复3次,两组间的差异比较采用双尾t检验,多组间比较使用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 靶基因的筛选及其KEGG和GO功能分析通过TargetScan、Starbase、miRDB和DIANA预测miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因,共筛选出24个共同靶基因(图1A)。然后对筛选出的24个共同靶基因进行KEGG和GO功能分析,KEGG通路分析及富集分类结果显示,这些共同靶基因与PI3K-AKT、Ras、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin kinase,mTOR)等信号通路相关(图1B、1C)。GO分析结果显示,在生物过程方面,主要富集在细胞分化、衰老调控、细胞分解代谢、氧化应激反应等;在细胞组分方面,主要富集在上皮细胞增殖、平滑肌细胞分化等(图1D)。
图1 生物信息学网站筛选并分析miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因
2.2 靶基因的蛋白互作分析STRING网站对24个靶基因进行蛋白-蛋白互作(PPI)分析,其中8个蛋白具有相互作用,且磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、神经母细胞瘤鼠肉瘤同系物(NRAS)、AKT3为排名靠前的3个蛋白,见图2A,图中圆圈代表节点,节点越大则介数中心度越大,边的粗细代表连接评分,边越粗,蛋白间的互作关系越强。通过文献查找、研究现状、miRNAs靶点评分、保守性分析等多方面的评估,初步确定AKT3为共同候选靶基因。AKT3的PPI分析结果显示其与mTOR、磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDPK1)、糖原合成酶激酶3β(GSK3B)等蛋白存在相互作用关系(图2B)。
图2 靶基因的蛋白互作网络分析A:候选靶基因的PPI分析;B:AKT3的PPI分析
2.3 miR-22-3p和miR-29a-3p mimics转染有效性检测qRT-PCR法检测miR-22-3p和miR-29a-3p在LX-2细胞中的表达水平。与对照组相比,miR-22-3p mimics组miR-22-3p表达水平明显升高,其相对表达量为42.72±3.77(t=19.16,P<0.000 1);miR-29a-3p mimics组miR-29a-3p表达水平明显升高,其相对表达量为53.09±6.02(t=14.97,P=0.000 1)。以上结果提示这两个miRNAs的mimics可有效升高LX-2细胞中相应miRNA的水平。
2.4 AKT3是miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因TargetScan查找并绘制miR-22-3p和miR-29a-3p与AKT3的结合位点图(图3A),RNAhybrid数据库查找分析miR-22-3p和miR-29a-3p与AKT3之间的最小配对结合自由能(MFE)分别为-106.3、-93.8 kJ/mol,提示均具有序列结合的可能性(图3B)。双萤光素酶报告实验结果(图3C)提示,质粒1含有miR-22-3p和miR-29a-3p的结合位点,分别与miR-22-3p或miR-29a-3p mimics共转染后,萤光素酶活性均显著降低,差异有统计学意义(F=310.9,P<0.000 1)。质粒2突变miR-22-3p结合位点,含有miR-29a-3p结合位点,与miR-22-3p mimics共转染后,其萤光素酶活性差异无统计学意义(t=0.867,P=0.43),而与miR-29a-3p mimics共转染后,其萤光素酶活性降低,差异有统计学意义(t=20.05,P<0.000 1)。质粒3含有miR-22-3p的结合位点,突变miR-29a-3p结合位点,与miR-22-3p mimics共转染后,其萤光素酶活性降低,差异有统计学意义(t=27.20,P<0.000 1),而与miR-29a-3p mimics共转染后,其萤光素酶活性差异无统计学意义(t=1.01,P=0.37)。质粒4均突变miR-22-3p和miR-29a-3p的结合位点,当与miR-22-3p或miR-29a-3p mimics共转染后,萤光素酶活性差异均无统计学意义(F=2.75,P=0.14)。以上结果表明AKT3是miR-22-3p和miR-29a-3p共同的靶基因。
图3 AKT3是miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶点
2.5 pcDNA3.1-AKT3质粒转染有效性检测qRT-PCR和Western blot实验检测各组细胞中AKT3 mRNA和蛋白的表达水平。pcDNA3.1-AKT3质粒转染LX-2细胞后,与pcDNA3.1组相比,细胞中AKT3 mRNA的相对表达量是15 880±1 641(t=16.76,P<0.000 1),蛋白的相对表达量是1.48±0.21(t=3.09,P=0.03),见图4。以上结果提示LX-2细胞中转染pcDNA3.1-AKT3后可有效升高细胞中AKT3的mRNA和蛋白表达水平。
图4 pcDNA3.1-AKT3质粒转染有效性检测
2.6 AKT3过表达逆转miR-22-3p和miR-29a-3p对LX-2细胞增殖的协同抑制作用CCK-8实验结果(图5)提示,在转染后的24、48、72、96 h,miR-22-3p和miR-29a-3p mimics不仅可以单独抑制LX-2细胞的增殖,二者的半剂量组合也可以协同抑制LX-2细胞的增殖;当pcDNA3.1-AKT3质粒与两个miRNAs mimics共转染时,两个miRNAs mimics对细胞增殖产生的抑制作用可以被部分逆转,差异有统计学意义(F24 h=229.4,F48 h=153.4,F72 h=89.5,F96 h=78.7,P<0.000 1),即AKT3过表达逆转miR-22-3p和miR-29a-3p对LX-2细胞增殖的协同抑制作用。
图5 AKT3过表达逆转miR-22-3p和miR-29a-3p对LX-2细胞增殖的协同抑制作用
2.7 AKT3过表达逆转miR-22-3p和miR-29a-3p对LX-2细胞迁移的协同抑制作用Transwell实验结果(图6)所示,miR-22-3p和miR-29a-3p mimics能够抑制LX-2细胞的迁移能力,且二者的半剂量组合可协同抑制LX-2细胞的迁移能力,pcDNA3.1-AKT3与两个miRNAs共转染后,两个mimics对LX-2细胞迁移的抑制作用被部分逆转,差异有统计学意与mimics NC+pcDNA3.1组比较:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与mimics NC+pcDNA3.1-AKT3组比较:#P<0.05,##P<0.01;与miR-22-3p mimics+pcDNA3.1比较:&P<0.05,&&P<0.01,&&&P<0.001;与miR-29a-3p mimics+pcDNA3.1组比较:$P<0.05,$$P<0.01;与miR-22-3p mimics+pcDNA3.1-AKT3比较:△P<0.05;与miR-29a-3p mimics+pcDNA3.1-AKT3比较:▲P<0.05,▲▲P<0.01;与miR-22-3p+miR-29a-3p mimics+pcDNA3.1组比较:@P<0.05,@@P<0.01义(F=95.17,P<0.000 1),即AKT3过表达可以逆转miR-22-3p和miR-29a-3p对LX-2细胞迁移的协同抑制作用。
图6 AKT3过表达逆转miR-22-3p和miR-29a-3p对LX-2细胞迁移的协同抑制作用
2.8 AKT3过表达逆转miR-22-3p和miR-29a-3p对LX-2细胞中纤维化标志物表达的协同抑制作用qRT-PCR结果显示,miR-22-3p和miR-29a-3p能够单独或协同抑制纤维化标志物α-SMA(F=41.54,P<0.000 1)和COL1A1(F=77.34,P<0.000 1)的mRNA表达,pcDNA3.1-AKT3与两个miRNAs共转染后,LX-2细胞中的α-SMA和COL1A1的mRNA表达水平降低可被AKT3过表达而逆转,差异有统计学意义,即AKT3过表达逆转miR-22-3p和miR-29a-3p对LX-2细胞中纤维化标志物表达的协同抑制作用,见图7。
图7 AKT3过表达逆转miR-22-3p和miR-29a-3p对LX-2中纤维化标志物表达的协同抑制作用
miRNAs生物学的一个重要特征就是单个miRNA可以靶向数百个mRNAs,从而调节整个蛋白质表达网络,一个mRNA可以被多个miRNAs靶向[5]。与这些特性相关的主要后果有两个,一是多个miRNAs和其他因素可能会竞争特定mRNAs上的结合位点;二是特定miRNAs靶标在不同细胞中的定位可以影响miRNAs和特定mRNAs之间的预期相互作用。关于两个或多个miRNAs通过靶基因对疾病的作用,已有研究[6]表明,miR-140e-5p和miR-146a的协同作用通过靶向Toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)信号传导对骨关节炎软骨细胞中炎症介质的产生具有很强的保护作用。circ-ERBIN通过靶向miR-125a-5p和miR-138-5p促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭、血管生成和转移,从而协同增加eIF4E结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,4EBP-1)的表达增强缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,HIF-1α)表达[7]。
miRNAs与靶基因的相关研究中,挽救实验是进一步验证二者之间靶定关系和调控作用的重要实验。过表达miR-1297或敲低自噬启动激酶1(ULK1)后可下调心肌纤维化小鼠原代心肌成纤维细胞中COL1A1和α-SMA的蛋白水平,ULK1过表达可以逆转miR-1297对心肌纤维化的调节作用[8]。过表达miR-10a-5p可明显抑制肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721的迁移、侵袭能力以及EMT进程,靶基因着丝粒复合体亚基1(SKA1)过表达逆转了miR-10a-5p对这两个肝癌细胞系的抑制作用[9]。Tuo et al[10]研究结果表明,miR-204-3p抑制间充质干细胞对巨噬细胞的极化作用,而过表达C-X-C基序趋化因子受体(CXCR4)抵消了这一过程。Ren et al[11]发现靶点DNAJC3-AS1可显著逆转miR-144诱导的阿霉素耐药的乳腺癌细胞系MCF-7的凋亡,逆转miR-144对自噬的抑制。miR-22-3p通过靶向丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)显著抑制破骨细胞的增殖并诱导其凋亡[12],miR-29a-3p能够抑制心脏成纤维细胞到肌成纤维细胞转化和肺动脉相关的心脏纤维化进展[13],课题组前期研究[14]显示miR-22-3p和miR-29a-3p能够抑制HSCs的活化以及肝纤维化的进程,但是二者联合应用发挥作用的机制目前未见相关报道。
本研究通过生物信息学分析结合双萤光素酶报告实验证明了AKT3为miR-22-3p和miR-29a-3p共同的靶基因,为进一步证明miR-22-3p和miR-29a-3p是通过靶向AKT3调控LX-2细胞的生物学效应,设计并进行挽救实验。CCK-8、Transwell、qRT-PCR实验结果提示,AKT3过表达能够逆转miR-22-3p和miR-29a-3p对LX-2细胞增殖、迁移能力以及肝纤维化标志物α-SMA和COL1A1 mRNA表达的协同抑制作用。
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