白宇，冯文雯，孙延庆，2
（1. 甘肃中医药大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730030；
2. 甘肃省人民医院血液内科，甘肃 兰州 730030）
慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是一种起源于造血干细胞恶性增殖性肿瘤。CML 全球年发病率为1.6/10万～2.0/10万，发病中位年龄为67岁［2］。目前，化疗是CML治疗的重要手段之一，而肿瘤多药耐药性（multidrug resistance，MDR）的产生，使其治疗效果仍不理想。多药耐药基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1） 的过度激活和产物P-糖蛋白（p-glycoprotein，P-gp）表达升高是多药耐药性产生的主要原因之一［3］。MDR1是ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）超家族成员之一，编码的P-gp 蛋白具有药物外排泵功能，已被证明与耐药复发有关［4］。此外，信号通路的调节和改变，在白血病耐药产生过程中也扮演了重要角色，包括经典的NF-κB［5］，BMP［6］，Wnt/β-catenin［7］，MAPK［8］等通路。胃癌细胞KATO III/VCR 中，过表达的抗凋亡蛋白Siva-1可激活NF-κB信号通路，引起MDR1 和MRP1 蛋白表达增加，促使胃癌细胞对 VCR、5-氟尿嘧啶和阿霉素的敏感性显著升高［9］。其他耐药相关机制还包括，凋亡通路阻断［10］，药物靶点改变［11］，表观遗传因素影响［11］，微小RNA 调控［12］及耐药细胞微环境［13］等。可见，探寻能够从多靶点、多机制逆转肿瘤多药耐药性的药物或方案具有重要意义。
近年来中药提取物已被广泛用于肿瘤耐药的治疗和研究当中，取得了一定疗效［14］。食用菌秦巴硒菇（Agaricus blazei）中多种提取物，被证实具有提高免疫力［15］，调节血脂血糖［16］，抑制肿瘤细胞增殖［17］，抗病毒［18］等功效。有研究发现，秦巴硒菇提取物FA-2-b-β 能增加3"-叠氮-3"-脱氧胸腺核苷（Zidovudine，AZT）对胃癌细胞的抑制率［19］，这提示FA-2b-β 可能与化疗药物的增敏有关，但具体作用方式和详细机制尚不明确。因此，本研究选取秦巴硒菇提取物FA-2-b-β，测定其对耐药细胞K562/ADR的增敏效果及凋亡作用，并对耐药基因MDR1及编码的P-gp蛋白，和NF-κB通路中关键分子p65进行检测，以期阐明FA-2b-β潜在作用机制，为CML 的临床治疗和用药提供新的思路。
1.1 细胞培养及分组
慢性髓系白血病K562 细胞由兰州大学第二附属医院实验室馈赠，K562/ADR 细胞购自于宁波明舟生物科技有限公司，在含有10%胎牛血清的RPMI1640 培养基培养中加入1 μg/mL 阿霉素（Adriamycin，ADR）维持K562/ADR耐药性，并置于37 ℃、含5%的CO2的条件下培养。试验分为空白组（2种细胞不加任何干预做对照）、秦巴硒菇FA-2-bβ干预组（对两种细胞施加FA-2b-β，浓度依次为1、1.5、2、2.5、3 mg/mL）、阿霉素干预组（对2种细胞施加阿霉素，分别测定其对阿霉素的反应，浓度依次为5、10、15、20 μmol/L），以及联合用药组（对耐药株K562/ADR 细胞施加低毒性秦巴硒菇FA-2-b-β干预，再联合阿霉素进行检测）。对于各药物浓度选取，参照本课题组前期研究以及相关文章确定。
1.2 试剂与仪器
秦巴硒菇提取物FA-2-b-β 由北京同仁堂成都有限公司提供，青霉素-链霉素混合液购自德国Hyclone 公司，胎牛血清购自以色列Biological Industries，总RNA 提取试剂盒试剂、Hifair®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR 反转录试剂盒、Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix 扩增试剂盒均购自上海翊圣生物科技有限公司，Annexin VFITC/PI双染凋亡试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，CCK-8 细胞计数试剂盒购自于奥默生物技术（上海）有限公司、BCA 试剂盒、ECL 化学发光显色试剂盒均购自中国上海碧云天生物公司，P-gp Mouse mAb、IκBα Rabbit mAb、p65 Mouse mAb、p53 Mouse mAb、BAX Rabbit mAb、BCL-2 Mouse mAb、HRP-山羊抗小鼠、HRP-山羊抗兔均购自于中国，Servicebio公司公司。荧光显微镜IX51购自日本奥林巴斯公司，酶标仪FC购自美国赛默飞公司，荧光定量PCR仪、凝胶成像分析仪购自美国伯乐Bio-Rad 公司，流式细胞仪FACSVia 购自美国BD公司。
1.3 CCK-8 法检测细胞存活率
依照5×104/mL 密度接种细胞于96孔板中，并用不同浓度FA-2-b-β以及阿霉素分别处理24、48、72 h后加入10 μL CCK 8 溶液，继续孵育2 h。酶标仪测量每孔450 nm 处光密度（D）值，计算抑制率及耐药倍数。
抑制率（%）=［1-（试验组D-空白组D）/（对照组D-空白组D）］×100%
选取FA-2-b-β对K562/ADR细胞的低毒浓度（IC90），并联合阿霉素再次干预K562/ADR 细胞，计算逆转倍数。
1.4 RT-PCR 检测细胞中相关基因mRNA 的表达
各浓度FA-2-b-β处理每组细胞48 h后，收集并提取总RNA，进行目的基因逆转录及扩增。反应体系为 20 μL，反应条件：95 ℃ DNA 聚合酶激活20 s，95 ℃变性 3 s、60 ℃退火/延伸30 s，共40个循环。rt-PCR 试验数据结果采用2-△△Ct进行分析，试验重复3次。
1.5 Western-blot 检测细胞中相关蛋白的表达
各浓度FA-2-b-β 处理细胞48 h 后，采用BCA法测定蛋白浓度，制胶并电泳，再将蛋白转至PVDF膜封闭2 h。洗去封闭液，一抗（1∶1 000）孵育4 ℃过夜。再加入对应二抗（1∶5 000），孵育2 h，TBST 洗膜3 次，最后加入ECL 发光液，反应2 min 后上机曝光。试验重复3 次。Image J 软件分析结果条带灰度值。
1.6 免疫荧光检测P-gp蛋白表达
将细胞以2×104个/孔接种于爬片上，经各浓度FA-2-b-β处理48 h后，待固定、封闭结束，加入一抗（1∶200）4 ℃孵育过夜，后加入荧光二抗（1∶500），室温避光孵育1.5 h，使用DAPI 染核 3 min，滴加荧光防淬灭剂封片，荧光显微镜下观察蛋白表达情况。
1.7 流式细胞术检测胞内药物蓄积情况
不同浓度FA-2-b-β（0、1、2、3 mg/mL）处理细胞48 h，吸弃培养基并清洗各孔，加入含10 μmol/L ADR 的新培养基，避光孵育2 h。加入300 μL 的预冷PBS重悬，尼龙网过滤后上机检测。
1.8 流式细胞术检测细胞凋亡
收集不同浓度各组处理后的细胞，PBS 清洗3次。依次加入Annexin V-FITC 结合液300 μL、Annexin V-FITC 5 μL、PI 5 μL 重悬细胞，4 ℃避光孵育15 min，尼龙网过滤后上机检测。
将细胞以2×104个/孔接种于爬片上，经各浓度FA-2-b-β处理48 h后，固定并加入DAPI染色剂染色5 min，PBS 清洗细胞于荧光显微镜下观察并拍照。
1.9 流式细胞术检测细胞周期
收集六孔板中处于对数生长期各组细胞，加入不同浓度FA-2-b-β 处理48 h 后弃上清，清洗1 次，无水乙醇于-20 ℃固定过夜。再次重悬细胞，加入100 μL 的RNase A，37 ℃ 孵育15 min，加入400 μL PI 染色，4 ℃避光孵育30 min，过滤并上机检测。Modfit软件分析结果。
1.10 统计学分析
采用SPSS 22.0统计软件进行分析。计量资料用xˉ±s表示，多组比较采用方差分析（ANOVA），两两比较使用配对t检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2.1 秦巴硒菇FA-2-b-β和阿霉素对K562、K562/ADR细胞增殖抑制作用
不同浓度FA-2-b-β 和阿霉素处理K562、K562/ADR 细胞后，存活率随浓度及时间增加而下降（图1）。秦巴硒菇FA-2-b-β对2种细胞的IC50分别为1.05、3.42 mg/mL；
ADR对2种细胞的IC50分别为0.452，18.2 μmol/L，耐药系数为40.2。
图1 秦巴硒菇提取物FA-2-b-β对CML细胞增殖的影响Figure 1 Effect of FA-2-b-β on CML cell proliferation
选取低毒浓度FA-2-b-β（IC90=1.08 mg/mL）干预后的K562/ADR细胞，发现此时ADR对K562/ADR 细胞的IC50为10.99 mg/mL，逆转耐药倍数为1.65倍（表1）。与对照组比较，经秦巴硒菇FA-2-bβ分别处理后的2种细胞抑制率均显著升高，且FA-2-b-β 联用阿霉素组细胞增殖抑制率较单用阿霉素组升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
表1 秦巴硒菇提取物FA-2-b-β对K562/ADR细胞的耐药逆转作用Table 1 Anti-drug reversal effect of FA-2-b-β on K562/ADR cells
倒置显微镜观察完全培养基中K562/ADR 细胞形态，Control 组（0 mg/mL）FA-2-b-β 中细胞胞质透亮均匀，核仁区域形态正常，细胞生长较好。试验组干预48 h 后各组细胞胞质染色加深，透光性减弱，凋亡细胞胞膜破裂，内容物大量释出并附着于膜上（图2）。提示FA-2-b-β 对K562/ADR 细胞生长具有明显抑制作用。
图2 秦巴硒菇提取物 FA-2-b-β对K562/ADR细胞干预48 h后形态学的影响Figure 2 Effect of FA-2-b-β on the morphology of K562/ADR cell intervention after 48 h
2.2 FA-2-b-β 对 K562/ADR 中耐药和凋亡相关基因mRNA表达水平的影响
RT-qPCR结果显示，经FA-2-b-β干预，K562/ADR细胞 Bax、TP53 mRNA表达上调，K562/ADR细胞 MDR1 及p65 mRNA 表达下调，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。
图3 秦巴硒菇提取物FA-2-b-β干预CML细胞48 h后相关基因mRNA表达水平的影响Figure 3 Effect of FA-2-b-β on mRNA expression levels after 48h in CML cells
2.3 FA-2-b-β 对FA-2-b-β 细胞耐药、凋亡及FA-2-b-β通路相关蛋白表达水平的影响
不同浓度FA-2b-β 处理K562/ADR 细胞48 h后，Western-blot结果显示，3 mg/mL组中P-gp、P65蛋白表达降低（图4-A），P53、Bax、IKB-α 蛋白表达升高（图4-B），与对照组相比有统计学差异（P＜0.05）。免疫荧光结果显示，各组细胞膜上P-gp蛋白荧光强度随药物浓度增加逐渐减弱（图5）。这与印迹结果大致一致。
图4 秦巴硒菇提取物FA-2-b-β作用于CML细胞48 h后相关蛋白表达水平的影响Figure 4 Effect of FA-2-b-β on the expression level of the associated protein after 48h in CML cells
图5 免疫荧光染色观察秦巴硒菇提取物FA-2-b-β干预K562/ADR细胞48 h后耐药蛋白P-gp表达水平Figure 5 Immunofluorescence staining to observe FA-2-b-β intervention in K562/ADR cells after 48 h of drugresistant proteins P-gp expression level
图6 胞内荧光染色观察秦巴硒菇提取物FA-2-b-β干预K562/ADR细胞48 h后胞内药物的蓄积量Figure 6 Intracellular fluorescence staining to observe the accumulation of intracellular drugs after 48 h of FA-2-b-β intervention in K562/ADR cells.
2.4 秦巴硒菇FA-2-b-β 对 K562/ADR 细胞内药物蓄积量的影响
FA-2-b-β（1、2、3 mg/mL）干预各组细胞48 h后结果显示，与对照组相比（0 mg/mL），K562/ADR细胞内阿霉素蓄积量随浓度增加而增加（P＜0.001）。
2.5 秦巴硒菇FA-2-b-β 对K562、K562/ADR 细胞凋亡的影响
细胞凋亡结果显示，与对照组比较，随着FA-2-b-β 浓度的增加，K562 细胞凋亡率依次为9.62%，36.68%，63.93%；
K562/ADR凋亡率依次为21.7%，54.44%，64.37%。DAPI 染色显示，处理后K562/ADR 组细胞核区荧光强度逐渐升高，细胞凋亡增多（图7）。
图7 流式细胞术观察秦巴硒菇提取物FA-2-b-β对CML细胞作用48 h后凋亡的影响Figure 7 Flow cytometry to observe the effect of FA-2-b-β on apoptosis of CML cells after 48 h
图8 DAPI染色观察秦巴硒菇提取物FA-2-b-β对K562/ADR细胞作用48 h后凋亡的影响Figure 8 DAPI staining observed the effect of FA-2-b-β on apoptosis of K562/ADR cells after 48 h
2.6 秦巴硒菇FA-2-b-β 对K562、K562/ADR 细胞周期的影响
K562、K562/ADR 细胞与不同浓度（1、2、3 mg/mL）FA-2-b-β共同孵育48 h，结果显示，与对照组相比，K562 细胞G0/G1百分比增加，依次为26.03%，43.77%，54.49%；
K562/ADR 细胞G2/M百分比增加，依次为21.7%，30.64%，35.1%，37.75%（图9）。
图9 秦巴硒菇提取物FA-2-b-β对CML细胞作用48 h后周期调控的影响Figure 9 Effect of FA-2-b-β on cell cycle regulation after 48 h of CML
化疗耐药是白血病治疗失败的主要原因之一。随着化疗药物和方案不断更新完善，白血病的治疗手段也有了更多选择。与此同时，肿瘤细胞所产生多药耐药问题也凸显出来。目前，调节耐药相关蛋白P-gp 表达及功能，是减少胞内化疗药物外排，提高化疗敏感性，是逆转肿瘤复发耐药的一个重要方向。例如，使用PI3K/mTOR 通路抑制剂Voxtalisib后，HL60/ADR和K562/A02中P-gp和MRP1基因的表达下调，并对阿霉素表现出一定的敏感性［20］。LncRNA FENDRR 还 能 够 通 过 miR-184/FENDRR/HuR/MDR1 信号通路来降低慢性粒细胞白血病中MDR1 蛋白的表达，以达到降低细胞对阿霉素耐药性的目的［21］。本研究通过对耐药株K562/ADR 使用秦巴硒菇提取物FA-2-b-β 干预，证实了FA-2-b-β 具有减少耐药蛋白P-gp 表达、增加胞内药物蓄积、阻滞细胞周期，并促进细胞凋亡的作用。同时也观察到，经典的NF-KB信号通路中关键蛋白表达也在药物干预后出现了变化。
经典NF-κB 信号通路中，RELA（p65）及NFKB1（p50）通过与IκB 的相互作用使其保持在非活性状态［22］。大量刺激物驱动（如炎症细胞因子、细菌脂多糖、病毒RNA，甚至神经递质等［23］）后，导致IκB中的IKK依赖性磷酸化和蛋白酶体降解，二聚体p65/p50解除抑制并分离，并由此激活和参与了体内多种基因表达和蛋白的调节。其中包括对多药耐药蛋白1（MDR1/P-gp） 的表达水平的调节。研究表明，在抑制PI3K/AKT/NF-κB 通路后，人乳腺癌细胞MCF-7/ADR 中P-糖蛋白（P-gp）的表达也随之降低，MCF-7/ADR 对阿霉素表现出较低的耐药性［24］。本研究发现，高浓度的FA-2b-β能够上调通路中抑制性蛋白IκB-α的表达，同时减少二聚体蛋白p65 的表达，对NF-κB 信号通路活性表现出了明显的抑制作用。这与结果中耐药蛋白MDR1的表达降低相一致。可见，提取物FA能够通过抑制经典NFκB信号通路，降低K562/ADR细胞中P-糖蛋白的表达，从而增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
肿瘤抑制因子p53 参与DNA 修复、代谢、细胞周期停滞、细胞凋亡和衰老的众多基因的转录［25］。一方面能诱导转化细胞的凋亡［26］，并在转录层面上上调凋亡相关蛋白（如Puma、Noxa、Bid 和Bax）表达，另一方面还可与Bcl-2 和Bcl-xL 的抗凋亡活性相互作用，共同调节细胞的凋亡过程［27］。p53的双重作用使得其发生的突变（主要是错义突变），能够抑制细胞凋亡，并导致治疗耐药性［28］。与p53突变相关的耐药包括顺铂，抗代谢物（吉西他滨），蒽环类药物（多柔比星），烷化剂（替莫唑胺）和具有特定靶标的药物，如EGFR抑制剂（西妥昔单抗）和抗雌激素（他莫昔芬）。可见，对于p53蛋白活性调节与肿瘤细胞耐药以及凋亡密切相关。本试验结果提示，经FA-2b-β 处理后，K562/ADR 细胞内p53 基因及蛋白产物的表达逐渐升高，同时促凋亡蛋白BAX表达也出现上升趋势。不难看出，FA-2b-β对K562/ADR 细胞所表现出的诱导凋亡作用，是通过调节p53蛋白及凋亡蛋白BAX 来实现的。BAX/Bcl-2 作为重要的凋亡相关蛋白，已被证实参与了多种肿瘤耐药的形成。据报道［29］，Bcl-2相关转录因子1 （BCLAF1）的过度表达是非小细胞肺癌A549/DDP细胞产生耐药性重要机制之一。而促凋亡蛋白Bax的表达下降也与肿瘤细胞多药耐药性的产生相关联［30］。上文已述，FA-2-b-β 能够上调Bax 表达，同时又表现出对NF-κB信号通路的抑制作用。这两种效应之间的关联，可能与Bax/BCl-2 结合该通路中抑制性蛋白IκB-α 并且促进其降解，从而增强NF-κB 通路的活性有关［31］，类似的，在其他白血病耐药相关研究中也发现了这一现象［32］。另外，流式细胞术也反映了FA-2-b-β 对K562 及K562/ADR 细胞的凋亡作用，并能够分别将2种细胞阻滞于G0/G1期和G2/M。此结果与本课题组前期研究相类似［33］。针对敏感株与耐药株所产生的不同阻滞效应，这可能和药物作用时所涉及到多个信号通路激活有关。在姜黄素诱导宫颈癌细胞凋亡的研究中，存在Wnt/β-catenin 和NF-κB 信号通路被药物共同抑制的现象，并将肿瘤细胞阻滞于G2/M 期［34］。本课题前期已证明，FA-2-b-β对K562细胞周期的阻滞及诱导凋亡作用均有wnt/β-catenin通路的参与［33］，在本研究中FA-2-b-β同样表现出了对经典的NF-κB 信号通路的显著抑制性，并能够诱导细胞发生凋亡和周期阻滞。由此，我们可以推论，FA-2-b-β在体内发挥逆转耐药及诱导肿瘤细胞凋亡的过程是多通路，多蛋白，多靶点共同参与完成的，对于该过程中所涉及到的具体信号通路及其明确的作用方式，有待后续更为深入研究来阐明。
综上，秦巴硒菇提取物FA-2-b-β 一方面抑制K562/ADR细胞中NF-κB信号通路活性，减少耐药基因及相关蛋白表达，并抑制转运蛋白功能。另一方面，FA-2-b-β上调促凋亡基因Bax和p53及相关蛋白，对K562/ADR 细胞生长发挥抑制和促凋亡作用。但对于更为具体作用机制和作用方式的探究，需结合后续体内试验做进一步论证。总之，秦巴硒菇提取物FA-2-b-β具有多靶点，多机制逆转K562/ADR细胞耐药性的潜在效力。
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