邓顺顺，梁国朝，梁灵君，高永双
（1.中山市第三人民医院检验科；
2.药剂科, 广东 中山 528400）
精神分裂症为精神科常见病、多发病,该疾病有着较高的致残率，疾病对于患者的家庭以及整个社会造成了极大负担[1]。该病是一种目前病因尚未明确的严重精神疾病,药物控制是精神分裂症的基本治疗手段[2]。第二代抗精神病药物也叫新型抗精神病药物,主要包括利培酮、奥氮平、氨磺必利等药物。与传统抗精神病药物比较，第二代抗精神病药物疗效更广、治疗作用更确切、安全性也更高等特点，已被临床广泛应用于精神分裂症患者的治疗[3］。有研究显示，仍然会有50%以上患者在服用第二代抗精神病药物之后会出现不同程度的不良反应，其中在体重方面体现的尤为突出，影响患者继续治疗依从性，不仅带来不好的主观体验，而且会增加疾病复发的风险［4-5］。
临床常用抗精神病治疗药物的疗效与药物的不良反应与其血药浓度密切相关，因此血药浓度监测( TDM ) 是精神科药物治疗方面的重要参考[6]。神经精神药理学与药物精神病学协会（AGNP）推荐临床使用奥氮平、利培酮或氨磺必利时进行治疗药物监测。本研究在以往研究的基础上[7-9]，建立一种可用于实验室常规开展，准确而快速的同时检测人血清中奥氮平、利培酮或氨磺必利的方法，进行方法学确证，提高TDM 的效率。
1.1 试剂 甲醇、乙腈（色谱纯），德国默克公司；
乙酸，广州化学试剂厂；
去离子水，自制。
1.2 试验药品 氨磺必利，批号200701；
奥氮平，批号：201502；
利培酮，批号：201704，纯度均＞99%,购于中国食品药品检定研究所；
内标氨磺必利-D5，批号：2-AMC-124-4；
奥氮平-D3，批号：6-QFY-169-3；
利培酮-D4，批号：3-KHI-168-3，纯度均＞99%,购于Toronto Research Chemicals 公司。
1.3 仪器设备 采用岛津8040 型号液质联用仪（日本SHIMADZU），配备有可调柱温箱 (CTO-20A)，氮气发生器（ATN-1050）,二元高压泵(LC-20AD)，自动进样器(SIL-20AHT-UFLC)；
台式高速冷冻离心机(Eppendorf 5424R 型)；
yi 移液枪(Eppendorf)，数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司，KQ-300DV 型）分析天平(Sartorins，B2T5S 型)；
混匀仪(艾本德MixMate 型) ；
帕恩特普通分析级纯水机(北京湘顺源，XYB-H 型)。
1.4 溶液配制
1.4.1 对照品工作溶液制备称取抗精神病药物奥氮平、利培酮和氨磺必利的标准对照品分别用一定量甲醇溶解配制成为10.00 ug·mL-1的储备液，保存于2～8℃冰箱备用。使用时再按需求按照一定比例用甲醇稀释成质控工作液和标准曲线工作液。
1.4.2 标准品与质控样品的制备 留取正常体检人员血清作为空白血清，取1.4.1 制备的对照品工作液10 μL，加入空白血清90 μL，混匀仪混匀1 min，分别配制成含不同药物的血清标准品溶液，然后按比例用甲醇溶解成含各分析物的质量浓度从低到高依次如下：奥氮平为5、10、25、50、100、250、500 和1 000 ng·mL-1，利培酮标准曲线为1、2、5、10、20、50、100 和200 ng·mL-1，氨磺必利为10、20、50、100、200、500、1 000 和2 000 ng·mL-1。用甲醇将血清标准品稀释成3 个质量浓度的质控品（低、中、高），各分析物浓度如下：奥氮平为100、500、800 ng·mL-1，利培酮为20、100、160ng·mL-1，氨磺必利为200、1000、1 600 ng·mL-1。
1.4.3 同位素内标工作溶液配制 用乙腈溶解奥氮平-D3、利培酮-D4 和氨磺必利-D5，分别配成质量浓度为100 ng·mL-1的内标工作液。
1.5 仪器条件
1.5.1 色谱条件 Phenomenex 预柱：Security Guard Ultra Cartridges (AJ0-8775)；
Phenomenex 色谱柱:Kinetex XB-C18,2.6 μm,3.0 x 50 mm；
柱温为45℃；
流速为0.4 mL·min-1；
流动相水相为0.1%乙酸水溶液，有机相为甲醇，线性梯度洗脱；
进样量为5 μL。
1.5.2 质谱条件 采用电喷雾电离（ESI）标准功能正离子模式，离子源温度为200 ℃，流速20.0 L·min-1，加热模块温度为450 ℃，采用多反应监测模式（MRM）质谱扫描方式，电喷雾压力为230 kPa。各物质前体与产物质荷比（m/z）分别为：奥氮平m/z 312.9→256.1，内标奥氮平-D3 m/z 316→256.1，利培酮m/z 411.2→191.1，内标利培酮-D4 m/z 415→195.1，氨磺必利m/z 370.2→242，内标氨磺必利-D5 m/z 375.2 →242，碰撞能量分别为26，22，22，26，45 和24 eV，裂解电压135e V。
2.1 样本的处理 在1.5 mL 的离心管中加入空白血清样本、标准品或质控品100 μL，加入内标溶液200 μL,，加入乙腈450 μL，混匀仪1 400 转/分混匀1 min，然后在4℃条件下15 000 rpm 离心10 min，用加样枪吸取100 μL 上清液置于带专用内插管的进样瓶中，进行质谱分析。
2.2 专属性试验 取4 份等量空白血清，第1 份不加任何物质，第2 份加入内标，第3 份加入分析物，第4 份同时加入分析物和内标，按照操作规程进行检测，进样检测分析，得到色谱图。奥氮平和奥氮平-D3 的保留时间约为2.31 min，利培酮和利培酮-D4 的保留时间约为2.42 min，氨磺必利和氨磺必利-D5 的保留时间约为2.36 min。检测结果：血清中基质不干扰分析物及内标成分的测定，专属性强。见图1。
图1 血清中3 中精神科药物检测的典型色谱图
2.3 标准曲线与定量下限 按“1.4.2 标准品与质控样品的制备”配制所得的标准品，稀释成由低到高8 个不同浓度的标准曲线的血清样品，按操作规程检测，检测两次。以峰面积与内标峰面积的比值作为纵坐标（y），以配制时的各分析物浓度为横坐标(x) ，采用加权( 1 /x2 ) 最小二乘法进行回归，得到各分析物标准曲线，见表1。
表1 标准曲线与定量下限验证结果
2.4 精密度与提取回收率试验 按“1.4.2 标准曲线与质控样品的制备”项制备的血清质控样品，按普通样本处理操作规程进行检测，一天内将同一批次的低、中、高三个水平样本独立检测5 次，检测间隔时间大于1 h，连续检测3 d，可得到45 个检测数据，并根据当批的标准曲线计算均值（x），相对标准偏差（RSD）,批内、批间的精密度。空白血清中加入不同浓度的对照品溶液后，配制成低、中、高三个水平的样本，每组每个浓度5 份样品，计算各均值，然后计算提取回收率。各分析物的准确度均在95.37%～105.72%，日内及日间精密度均＜15%，见表2。
表2 精密度与回收率验证结果
2.5 稳定性试验 按“1.4.2 标准曲线与质控样品的制备”项制备各分析物质控血清样品（低、中、高3个浓度）各3 份，考察其在常温避光条件下放置1 h和24 h、-20 ℃保存条件下存放1 d 和14 d 的稳定性。验证结果：质控样品在常温避光条件下放置1 h 和24 h、-20 ℃保存7 d 和14 d 的条件下，RSD 均小于15%，结果稳定。
2.6 基质效应 制备标准品纯溶液，血清加标样本以及两者1:1 的混合液，分别前处理后测定3 次。计算三种溶液3 次测定的峰面积 （目标化合物峰面积和内标峰面积比值）均值，1:1 混合样本的均值相比血清加标样本和标准品纯溶液的均值的偏差。验证结果奥氮平、利培酮和氨磺必利的偏差均小于15%，目标分析物在生物样本和纯溶液中的质谱响应无差异，不影响目标分析物的准确定量。
目前，尽管许多国家与地区的精神分裂症治疗指南，均推荐单一抗精神病药治疗原则，但实际临床上联合用药很常见[10], 有些联合用药甚至超过50%[11]。当患者联合用药时，需要进行每一种药物的TDM 检测，如果能一管血同时检测其所有药物的药物浓度，那将会极大的缩短检测时间，提高检测效率，并减轻患者多次采血的负担，临床运用会更加广泛。基于质谱具有分析敏感性和特异性，并能够在单个过程中测量多种化合物[12]。这是一种监测接受多种药物治疗的患者的经济、有效的方法［13］。目前TDM 多采用高效液相色谱、荧光偏振免疫分析等方法，其对应的仪器平台分别是高效液相色谱仪和免疫分析仪[14], 对于某些临床化学和毒理学分析物，液相色谱(LC)与串联质谱(MS/MS)配对提供了优于免疫测定的传统测试的优势[12]。本实验室采用的是液相色谱三重四极杆质谱联用仪，HPLCMS/MS 检测方法。
本研究旨在建立一种同时监测奥氮平、利培酮和氨磺必利的HPLC-MS/MS 方法。在本实验过程中采用乙腈蛋白沉淀法对样品进行处理，与液-液萃取法、固相萃取法相比，不但提高了灵敏度，而且有利于改善峰型[15]。本研究采用同位素化合物作为内标，同位素内标与分析物离子可简化色谱行为，确保质谱行为一致，有效降低溶血、高脂血以及高胆红素血样等特殊血样对检测的影响[16]。本方法验证过程符合生物样品定量分析方法验证指导原则[17]，验证该方法的专属性、线性范围、灵敏度、和基质效应等，均能满足该方法同时检测奥氮平、利培酮和氨磺必利三种精神类药物的研究要求，检测中所需标本量少，检测速度快，能提高临床检测效率和检测质量，可以进行日常检测。
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