吴以龙 谢晶晶 黄丽静 夏宁宁 江志俊 黄兆许 陈津津
幽门螺杆菌（Hp）是一种微需氧、革兰阴性菌，Hp感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤等上消化道疾病密切相关，并被确定为胃癌的Ⅰ类致癌物[1-2]。选用敏感的抗生素根除Hp是防治相关疾病的有效方法[3]，并且对降低中国Hp感染率具有重要意义[4]。由于抗生素的广泛使用和Hp根除治疗的大量开展，Hp的耐药率逐渐升高，且存在明显的地域差异[5]。Hp的关键抗菌靶基因发生突变可能使其逃避抗生素的杀菌作用，23S rRNA 基因V 区突变使核糖体与克拉霉素的亲合力降低，这是导致Hp对克拉霉素耐药的主要原因，并且23S rRNA 基因的突变位点和突变形式存在地域差异。机体对氟喹诺酮类药物耐药主要是由于喹诺酮类药物耐药决定区（QRDR）发生突变所致[6-8]。本课题组前期研究结果显示，闽浙边界地区为Hp抗菌药物的高耐药区域，总体耐药率达98.8%[9]。研究显示，在发生肠上皮化生的胃黏膜表面，Hp通常无法定殖，通过蓝激光成像结合放大内镜（BLI-ME）观察时，可见肠上皮化生黏膜上皮表面呈蓝色嵴状结构，即为亮蓝嵴。本研究使用BLI-ME 指导靶向活体组织检查，避开肠化生上皮，提高Hp培养阳性率，再进行药物敏感度体外实验，进一步了解Hp感染的单药、双重及三重耐药情况及患者临床特征，并对分离得到的克拉霉素耐药菌株的23S rRNA 基因序列和左氧氟沙星耐药菌株的gyrA基因序列进行检测和分析，探讨其耐药机制，以期为闽浙边界地区Hp的临床治疗提供参考依据。
1.1 研究对象
选择2019 年10 月至2020 年1 月闽浙边界地区417 例因上消化道症状于福建中医药大学附属福鼎医院消化内镜中心行胃镜检查及胃黏膜活体组织检查者，从其中247 例患者中成功分离得到Hp菌株（即247 株）。247 例患者中男性135 例，女性112 例，年龄20～83 岁，平均年龄为（49.55±11.12）岁。纳入标准：（1）有上消化道症状者，上消化道症状包括上腹痛或烧灼感、餐后上腹饱胀感和早饱感的症候群，可伴食欲不振、嗳气、恶心或呕吐等；
（2）行胃镜检查及胃黏膜活体组织检查者；
（3）签署知情同意书。排除标准：（1）近4 周内曾使用抗菌药物、铋剂、质子泵抑制剂或H2受体阻滞剂者；
（2）妊娠期或哺乳期妇女；
（3）严重系统性疾病患者，如肝病、心肺疾病等；
（4）不能正确表达主诉者，如患有精神疾病及不能配合者；
（5）非长期居住于福建省宁德市及浙江省温州市者（居住年限＜5年）。本研究获得医院医学伦理委员会批准[鼎医综（2020）4 号]。
1.2 Hp 培养、鉴定及抗菌药物敏感度体外实验
使用BLI-ME 指导靶向活体组织检查，避开肠化生上皮，分别取胃窦、胃体处的胃黏膜组织，置于装有0.5 mL 转运液的无菌EP 管中，用干冰保温，48 h 内运送至实验室，用巴氏吸管将胃黏膜组织转移至研磨器，充分研磨成匀浆后，接种于含5%脱纤维绵羊血的哥伦比亚琼脂平板上，均匀涂开后，置于37 ℃的三气培养箱（含5% O2、10% CO2和85% N2）中培养3～7 d，观察细菌生长情况。可疑菌落（透明或半透明的针尖样菌落）经涂片镜检结果显示细菌形态符合Hp特征，且生物化学反应（尿素酶、氧化酶和过氧化氢酶实验）均呈阳性的菌株，判定为Hp菌株。
采用琼脂稀释法，对阳性菌株进行抗菌药物耐药性检测。在6 种抗菌药物溶液中分别加入琼脂并稀释至相应的临界点耐药浓度，倾注平板；
用移液器将2 μL 菌悬液滴加至平板上，待其干燥后，置于37 ℃三气培养箱（湿度＞80%）中，培养3 d 后判读药物敏感度体外实验检测结果，若接种点有菌生长，则该菌株判读为耐药。6 种抗菌药物耐药判定标准设定为：克拉霉素1 μg/mL，左氧氟沙星2 μg/mL，甲硝唑8 μg/mL，阿莫西林2 μg/mL，呋 喃 唑 酮2 μg/mL 和 四 环 素2 μg/mL[10]。
以HpATCC 26695 作为质控菌株。
1.3 基因测序
随机选取分离出的克拉霉素和左氧氟沙星耐药菌株各50 株，使用基因组DNA 提取试剂盒（购自美国Invitrogen 公司），按照说明书操作，提取Hp基因组。采用PCR 法扩增克拉霉素耐药相关基因23S rRNA 和左氧氟沙星耐药相关基因gyrA[6-8]。针对目的基因设计引物，引物序列见表1。对扩增后的产物测序、比对，确定序列正确无误。PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min；
之后95 ℃变性20 s、57 ℃退火20 s、72 ℃延伸90 s，共35 个循环；
最后72 ℃延伸5 min。采用琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物并拍照。采用Sanger 法对PCR 产物进行测序，对测序后的峰图进行拼接，所得序列与Genbank 中HpATCC 26695 的23S rRNA 基因序列和gyrA基因序列进行比对、分析。
表1 耐药相关基因的引物序列
1.4 统计学方法
应用SPSS 25.0 软件对数据进行统计学分析。计数资料以例/株（%）表示，独立样本率的比较采用卡方检验及Fisher 精确检验，趋势检验采用卡方线性趋势检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 Hp 菌株耐药情况及其与患者年龄的关系
247 例 患 者 按 年 龄 分 为≤20 岁 组（2 例）、21～40 岁 组（45 例）、41～60 岁 组（163 例）和＞60 岁组（37 例）。247 株Hp菌株的总体耐药率为98.8%（244 株），其中甲硝唑的耐药率[96.4%（238株）]最高，其次为左氧氟沙星[45.7%（113 株）]，克拉霉素的耐药率达40.9%（101 株）。各年龄组中Hp菌株对甲硝唑的耐药率均高于95.0%（分别为100.0%、97.8%、95.1%和100.0%）。各年龄组均未发现阿莫西林、呋喃唑酮和四环素耐药菌株。随着年龄增长，Hp菌株对左氧氟沙星的耐药率呈升高趋势（各组分别为0、22.0%、45.0%和78.0%；
R2=0.990，P＜0.05）；
此外，Hp菌株对甲硝唑和左氧氟沙星的双重耐药率（各组分别为0、8.9%、22.7%和29.7%；
R2=0.986，P＜0.05），以及对甲硝唑、左氧氟沙星和克拉霉素的三重耐药率（各组分别为0、11.1%、20.2% 和48.6%；
R2=0.925，P＜0.05）也均随年龄增长而升高。各年龄组对克拉霉素的耐药率分别为100.0%、44.4%、35.6%和56.8%，平均耐药率为40.9%。见图1。
图1 不同年龄患者Hp 菌株耐药率变化趋势
2.2 克拉霉素耐药菌株的23S rRNA 基因突变情况
50 株克拉霉素耐药菌株经PCR 后均扩增出23S rRNA 基因的目的片段，长度为2 975 bp。扩增样本测序结果显示，50 株耐药菌株均发生23S rRNA 基 因V 区（2055～2899） 突 变， 共 发 现4种突变类型，其中A2143G 的突变率为100%，T2182C 的突变率为60%，A2302G 的突变率为24%，G2864A 的突变率为98%。见图2、图3。
图2 DNA Marker 的电泳条带 A DNA Marker D2000 PCR 电泳条带 B DNA Marker D15000 PCR 电泳条带
图3 部分克拉霉素耐药菌株23S rRNA 基因PCR 扩增产物电泳图谱及耐药位点测序峰图 A 克拉霉素耐药菌株23S rRNA 基因 B 未发生突变的23S rRNA 基因 C 发生A2143G 突变的23S rRNA 基因
2.3 左氧氟沙星耐药菌株的gyrA 基因突变情况
50 株左氧氟沙星耐药菌株经PCR 后均扩增出gyrA基因的目的片段，长度为2 484 bp。扩增标本测序结果显示，50 株耐药菌株均发生gyrA基因QRDR 突变，突变位置是第87 位和第91 位氨基酸。32 株为第87 位氨基酸纯合突变（N87K/Y/I），15 株为第91 位氨基酸纯合突变（D91N/Y），1 株为第87 位氨基酸杂合突变（N87Y、N87I），1 株为第91 位氨基酸杂合突变（D91Y、D91N），1 株为第87 位氨基酸和第91 位氨基酸杂合突变（N87Y、D91Y）。见图4。
图4 部分左氧氟沙星耐药菌株gyrA 基因PCR 扩增产物电泳图谱及耐药位点测序峰图 A 左氧氟沙星耐药菌株gyrA 基因 B 未发生突变的gyrA 基因 C 发生Asn87Lys 纯合突变的gyrA 基因 D 发生Asp91Asn 纯合突变的gyrA 基因
研究表明，部分地域的Hp根除率＜80%[11]；
在Hp高耐药地域，经验性用药对Hp的根除率约为70%[12]。导致Hp根除失败的原因包括对抗菌药物耐药、患者依从性差、环境因素、质子泵抑制剂的快速代谢等[4,11]，对抗菌药物耐药是其中最重要的原因。由于不同国家、不同地区的Hp耐药性不同，根除方案的制定需因地制宜。近年来在中国，Hp对左氧氟沙星、克拉霉素和甲硝唑的耐药率呈逐年升高趋势[5]，并且不断出现多重耐药现象[13]。研究显示，中国东南沿海地区Hp对甲硝唑、克拉霉素及左氧氟沙星的耐药率分别为95.4%、21.5%和20.6%[14]。本研究结果显示，随着年龄增长，左氧氟沙星的耐药率逐渐升高，特别是＞60 岁患者的耐药率高达78%，这可能与老年患者因呼吸道感染、泌尿系统感染而常使用喹诺酮类药物有关；
克拉霉素在各年龄段的耐药率均＞20.0%，平均耐药率达40.9%，建议使用前先进行药物敏感度试验。本研究中各年龄段均出现双重耐药，除了≤20岁组，其他各年龄段均出现三重耐药，甲硝唑和左氧氟沙星的双重耐药率，以及甲硝唑、左氧氟沙星和克拉霉素的三重耐药率均随着年龄增长而升高。
本地区对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药率较高，对其耐药机制的探讨意义重大。Hp抗菌药物的耐药机制复杂，主要与抗菌作用关键靶点相关基因的突变有关。克拉霉素属于大环内酯类抗生素，其通过与Hp核糖体紧密结合后作用于细菌23S rRNA 基因V 区的多肽转移酶环，抑制细菌蛋白质的合成而发挥抑菌作用，23S rRNA 基因V 区突变使核糖体与克拉霉素的亲合力降低，导致Hp对克拉霉素耐药。23S rRNA 基因的突变位点和突变形式具有地域差异，突变位点包括A2142C、A2142G、A2143G、A2146C、A2147G、A2223G 和T2182C 等[15]。本研究结果显示，本地区克拉霉素耐药菌株均发生A2143G 突变，这与浙江地区的研究结果相符[16]；
本地区克拉霉素耐药菌株有60%发生T2182C 突变，但T2182C 突变是否与耐药相关，仍存在争议；
此外，本研究发现克拉霉素耐药菌株A2302G 突变率为24%，G2864A 突变率为98%，以往少见有相关报道，这可能与本地区克拉霉素高耐药有关，仍待进一步验证。
左氧氟沙星属于氟喹诺酮类药物，其对Hp的抗菌机制是通过抑制细菌DNA 旋转酶，从而干扰细菌DNA 复制；
氟喹诺酮类药物的耐药主要是由其DNA 旋转酶上的gyrA基因QRDR 发生突变所致，gyrA基因耐药突变区域主要集中在第67～106位氨基酸[7]，该区域的突变在氟喹诺酮类药物耐药方面具有十分重要的作用。研究表明，第87 位、第91 位氨基酸突变是导致Hp产生耐药的主要原因[17]。本研究结果显示，50 株左氧氟沙星耐药菌株均发生gyrA基因QRDR 突变，突变位置是第87位和第91 位氨基酸，其中32 株是第87 位氨基酸突变，15 株是第91 位氨基酸突变，这与浙江地区的研究结果相符[16]。
由于本地区Hp耐药率较高，根据耐药情况指导临床用药可提高Hp根除率，从而减少医疗资源的浪费。细菌培养和药物敏感度试验是判断Hp耐药性的金标准，但该方法操作较复杂、耗时较长，培养条件较高，常规实验室无法开展，且敏感度偏低。通过检测耐药突变基因而判断耐药性属于分子生物学方法，其具有快速、简便、敏感度高等优势，是未来的发展方向[18-19]。本研究结果显示，本地区克拉霉素耐药菌株100%发生A2143G 突变，可通过检测A2143G 突变情况判断Hp对克拉霉素的耐药性；
本地区左氧氟沙星耐药菌株100%发生gyrA基因QRDR 突变，突变位置是第87 位和第91位氨基酸，因此可通过检测QRDR 的第87 位、第91 位氨基酸突变情况，判断Hp对左氧氟沙星的耐药性。
对于闽浙边界地区的Hp患者，应首选基于药物敏感度试验结果的个体化Hp根除方案。因分子生物学方法仍处于研究阶段，能否应用于临床尚需进一步验证，因此本地区目前仍推荐采用细菌分离、培养和药物敏感度体外实验等方法，并可通过BLI-ME 靶向活体组织检查以提高Hp培养阳性率。今后本课题组将扩大研究规模、扩大样本量，以期客观全面地了解闽浙边界地区Hp菌株耐药相关基因的突变情况，为未来通过分子生物学方法检测耐药突变基因而指导临床用药提供理论依据。
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