张园清,张春丹,陈斌卿,江 娇,郑中尧,郭 莹,刘坤祥,徐 虹
(西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌,712100)
铵态氮是作物根系直接吸收利用氮素的重要形态之一,但国内农业生产长期施用铵态氮肥,导致土壤中累积过多的NH4+,远远超过了作物生长所需的最适含量(0.1～0.5 mmol·L-1),进而造成铵盐毒害[1]。在一些近水滩地、湖泊洼地和海滨盐渍土壤中,缺氧引起的反硝化作用和硝酸盐异化效应[2]使大量硝态氮被还原成铵态氮,又加剧了土壤的铵盐毒害。因此,高铵胁迫已成为目前农业生产中面临的一个重要环境问题,而一些盐碱地植物可能同时受到高盐与高铵的双重胁迫。
植物谷氨酰胺合成酶(GS)有两种形式,分别是定位于细胞质的GS1和定位于叶绿体的GS2。GS1主要参与同化根吸收的NH4+以及叶片衰老过程中的氮素再利用;GS2可同化光呼吸过程所释放的NH4+[3]。当土壤中NH4+浓度过高时,根吸收的NH4+会立即被GS1同化为谷氨酸,在细胞中会产生大量质子,从而加重酸负荷并导致植物中毒[4-5];当NH4+的供应量超过根最大的储存和同化能力时,NH4+可通过木质部被转移到地上[6]。在盐胁迫条件下,低盐诱导GS基因的表达,高盐则抑制GS的活性[7-8]。Hoshida等[9]研究表明,过表达GS2基因可提高水稻的耐盐性。Sahu等[10]研究表明,盐胁迫条件下,耐铵水稻品种具有更高的GS活性。上述研究结果表明,GS参与植物对高铵和高盐胁迫的响应过程,并推测这两种胁迫下的响应机制相似。研究植物在高铵和高盐胁迫下GS的调控机制,可为筛选兼具耐高铵及高盐特性的优良品系提供理论依据。
小麦作为旱生作物,对高铵胁迫敏感[11-12],在基因组中有12个编码GS的基因(9个TaGS1和3个TaGS2[13]),协同完成小麦的氮素同化与转运[14-16]。GS活性与小麦的氮素利用率和最终产量密切相关,在一些低氮高效型小麦品种中,开花后GS活性显著增加[17]。
铜麦6号是陕西省铜川市选育的旱地国审小麦新品种,具有综合抗性好、高产稳产的优良特性,已在黄淮冬麦区旱地大面积推广。研究表明,铜麦6号对低温、盐、干旱及其多重胁迫均具有较强的耐受性[18]。本研究以铜麦6号为试验材料,探讨高铵、高盐及其双重胁迫对小麦苗期生长的影响,分析小麦GS基因家族成员(根中的TaGS1;1、TaGS1;2和TaGS1;3基因以及叶片中的TaGS2基因)在逆境胁迫下的表达模式,初步揭示其对高铵与高盐胁迫的响应机制,以期探索铜麦6号在盐碱地种植的可行性,并建立以TaGS为指标,筛选耐高铵与高盐小麦新种质的选育体系。
1.1 供试材料
供试小麦品种铜麦6号由陕西省大唐种业股份有限公司提供;对照品种中国春由本实验室种植保存;烟农19 (抗旱,耐盐碱)[19]购自山东省祥丰种业有限责任公司;三抗10号(耐盐碱)、矮优王(即三抗矮优王,抗旱)、烟农21(抗旱)购自济南朝晖种业有限公司;山农25(抗旱)购自淄博博信农业科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 高铵与高盐处理下小麦种子发芽率的检测
取供试小麦品种的种子,用75%的酒精溶液浸种1 min,然后用清水冲洗3次;室温浸种萌发2 d至种子露白后,转移至铺有滤纸的9 cm培养皿中,分别用170 mmol·L-1NaCl和10 mmol·L-1NH4Cl溶液进行高盐和高铵处理,以蒸馏水为对照,每皿种子50粒,每个处理3次重复;培养3 d后,以胚芽长≥0.3 cm为标准检测种子发芽势;培养7 d后,分别用10 mmol·L-1KNO3、10 mmol·L-1KNO3+170 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1NH4Cl溶液继续培养萌发的小麦种子4 d,观察胚芽生长情况,统计胚芽长≥ 0.5 cm的种子数,计算发芽率。
1.2.2 高铵与高盐处理下小麦幼苗形态指标的测定
以铜麦6号和中国春为材料,消毒后浸种萌发,然后进行水培试验;取培养5 d至一叶期的小麦幼苗,移栽至弘博莱公司生产的水培盒中,在植物光照培养箱(25±1℃,16 h光照/8 h黑暗,光照强度3 000 Lux)中继续培养2 d后,分别用85 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1NH4Cl、85 mmol·L-1NaCl+10 mmo·L-1NH4Cl进行培养,以蒸馏水为对照,每3 d更换一次溶液。分别在处理后的第0、1、3、5、7天取样,测量幼苗单株叶片和根的鲜重、主根和第一叶叶片的长度,并计算根冠比(幼苗单株根鲜重与叶片鲜重的比值),比较分析中国春与铜麦6号的差异。
1.2.3 高铵与高盐处理下小麦幼苗GS家族基因的表达模式分析
主要检测小麦GS基因家族中TaGS1;1、TaGS1;2和TaGS1;3基因(根系)以及TaGS2基因(叶片)的表达模式。采用1.2.2处理后-80 ℃冻存的小麦叶片和根组织约0.1 g,液氮研磨至干粉,加1 mL Trizol(西安海宁生物工程有限公司)提取总RNA,提取步骤按照说明书进行,用Nanodrop紫外分光光度计测定RNA的浓度。用UEIris RT mix with DNase(All-in-One)反转录试剂盒(苏州宇恒生物科技有限公司),按照说明书将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板,用2×SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒(苏州宇恒生物科技有限公司),在BioRad CFX Opus 384实时定量PCR仪上进行qRT-PCR。PCR反应体系为20 μL,包括2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,cDNA模板2 μL,RNase free water 7 μL。PCR反应程序:95 ℃ 120 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环;溶解曲线按照仪器提供的标准流程执行。参考韦一昊等[13]设计的引物(表1),由杨凌天润生物科技有限公司合成。以TaTEF1为内参基因。采取2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量,3次生物学重复,用SPSS 22软件进行数据统计与显著性分析。
表1 本研究所用的qRT-PCR引物
2.1 高铵与高盐处理对小麦种子发芽势的影响
由表2可以看出,对照处理下,铜麦6号和中国春的种子发芽势均大于80%,但与烟农19、三抗10号和烟农21无显著差异,显著高于矮优王和山农25。高铵处理下,铜麦6号的种子发芽势最高,达84.00%,但与中国春、三抗10号和矮优王无显著差异,显著高于烟农19、山农25和烟农21。高盐处理下,所有小麦的种子发芽势均明显降低,其中铜麦6号的种子发芽势最高,但与烟农19无显著差异,显著高于其他5个品种。总的来看,高铵和高盐处理下所有品种的种子发芽势均有所降低,但铜麦6号在高铵处理下,与对照处理差异不明显,仍具有相对较高的发芽势,而在高盐处理下明显下降。
表2 高铵和高盐处理对小麦种子发芽势的影响
由于高盐处理抑制了种子的萌发和幼芽的伸长,影响后续观察与分析,种子萌发后第4 d,用10 mmol·L-1KNO3溶液代替蒸馏水作为对照,用10 mmol·L-1KNO3+ 170 mmol·L-1NaCl代替170 mmol·L-1NaCl作为高盐处理,补充一定的氮源,消除单盐毒害的影响。在不同的处理溶液中继续培养4 d,统计发芽率。从表3可以看出,大多数品种在外加氮源(KNO3)后,促进了种子的萌发。在10 mmol·L-1NH4Cl(高铵)处理下,铜麦6号的发芽率最高,显著高于烟农19、矮优王、山农25和烟农21,但与中国春和三抗10号无显著差异。在170 mmol·L-1NaCl + 10 mmol·L-1KNO3(高盐)处理下,烟农19的发芽势最高,但与铜麦6号无显著差异,显著高于其他品种。
表3 外加氮源条件下高铵和高盐处理下小麦品种的发芽势
按照耐铵指数(10 mmol·L-1NH4Cl 与10 mmol·L-1KNO3两个处理下发芽率的比值)排序,从高到低依次为铜麦6号>三抗10号>矮优王>山农25 >中国春>烟农19 >烟农21;按照耐盐指数(170 mmol·L-1NaCl +10 mmol·L-1KNO3与10 mmol·L-1KNO3两个处理下发芽率的比值)排序,从高到低依次为烟农19 >铜麦6号>山农25 >中国春>三抗10号>矮优王>烟农21。后续试验分析选择耐铵性与耐盐性都与铜麦6号有较大差异的中国春作为对照品种,进一步比较高铵与高盐胁迫对铜麦6号幼苗生长的影响。
2.2 高铵、高盐及其双重处理对小麦幼苗生长的影响
2.2.1 高铵、高盐及其双重处理对小麦幼苗鲜重的影响
由图1可以看出,对照处理的种子水培14 d后,叶片和根的鲜重均有所下降,说明靠种子自身贮存的营养,小麦幼苗大约可以维持14 d的生长。高铵处理下铜麦6号幼苗的叶片鲜重持续增加,中国春幼苗在处理3 d后,叶片鲜重有所下降。高铵处理抑制了小麦幼苗根的生长,在处理7 d后对中国春根系生长的抑制作用大于铜麦6号。高盐以及高铵与高盐双重处理3～7 d后,对小麦幼苗根的生长都有抑制作用,且对中国春的抑制作用大于铜麦6号。铜麦6号的幼苗叶片鲜重在高盐处理1～5 d均持续增加,在处理5 d后开始下降,而中国春的幼苗叶片鲜重在处理3 d后就开始下降。
H2O:对照处理;NH4Cl:高铵处理;NaCl:高盐处理;NaCl+NH4Cl:高铵与高盐双重胁迫处理。图2～6同。
对高铵、高盐及其双重处理7 d后两品种的幼苗叶片和根的鲜重进行分析,从图2可以看出,与对照处理相比,除高铵处理下铜麦6号的叶片鲜重有所提高外,高铵、高盐及其双重处理下两品种的叶片和根的鲜重均有所降低,且三个处理下铜麦6号的叶片鲜重,以及高盐处理下铜麦6号的根鲜重均显著高于中国春。总的来看,三种处理对中国春幼苗的伤害更大,说明铜麦6号具有较强的耐高铵和耐高盐特性。
**和***分别表示中国春和铜麦6号在0.01和0.001水平上差异显著。图3～5同。
2.2.2 高铵、高盐及其双重处理对小麦幼苗叶片和主根长度的影响
对高铵、高盐及其双处理7 d后两品种的叶片和主根长度进行分析,从图3可以看出,与对照处理相比,三种处理均抑制了两品种幼苗的叶片伸长,且对中国春的抑制程度大于铜麦6号,三种处理下铜麦6号的叶片长度均显著高于中国春。与叶片有所不同,高铵处理促进了中国春和铜麦6号幼苗的主根伸长,高盐处理抑制了两个品种幼苗的主根伸长,而高铵与高盐双重处理抑制了中国春幼苗的主根伸长,但对铜麦6号的抑制作用不明显。高铵、高盐处理下两品种的主根长度无显著差异,而高铵与高盐双重处理下,铜麦6号的主根长度显著高于中国春。
*表示中国春和铜麦6号在0.05水平上差异显著。图4～5同。
综合比较图1、图2和图3,发现持续7 d的高铵、高盐及其双重处理均影响小麦幼苗的生长,对叶片和根的影响略有不同,品种间存在差异。高铵处理对幼苗生长的影响较小,但会降低幼苗根鲜重和第一叶叶片长度。高盐处理会显著抑制幼苗的生长以及根伸长。大多数情况下,铜麦6号幼苗的生长优于中国春,具有较强的耐高铵和耐高盐特性;而中国春对高盐胁迫较敏感,具有一定的耐高铵特性。
2.2.3 高铵、高盐及其双重处理对小麦幼苗根冠比的影响
从图4可以看出,对照处理下,中国春的根冠比在处理0、1、5和7 d均显著小于铜麦6号。在高铵、高盐及其双重处理下,相对于对照处理,两品种的根冠比均有所降低。高铵、高盐处理7 d后,铜麦6号的根冠比显著大于中国春;高铵与高盐双重处理7 d后,铜麦6号与中国春的根冠比差异不显著。铜麦6号的根冠比除高盐处理1 d后显著小于中国春外,其他处理不同时间点均大于中国春,推测这与铜麦6号是旱地小麦品种有关,根系发达、根冠比大是旱地小麦共有的形态特征。
图4 不同处理对中国春和铜麦6号幼苗根冠比的影响
2.3 高铵、高盐及其双重处理对小麦幼苗TaGS基因表达的影响
2.3.1 根中TaGS1;1、TaGS1;2和TaGS1;3基因的表达模式
从图5可以看出,在高铵处理下,两品种TaGS1;1基因的相对表达量随处理时间的延长呈持续升高的变化趋势,在处理1～7 d后中国春TaGS1;1基因的表达量均显著高于铜麦6号;在高盐处理下,两品种TaGS1;1基因的相对表达量随处理时间的延长均呈先升后降的变化趋势,均在处理5 d后达到峰值,在处理5～7 d后铜麦6号的表达量显著高于中国春;在高铵与高盐双重处理下,两品种TaGS1;1基因的相对表达量随处理时间的延长均呈“升-降-升”的变化趋势,中国春在处理7 d后达到峰值,铜麦6号在处理5 d后达到峰值,在处理1～7 d后中国春TaGS1;1基因的表达量均显著高于铜麦6号。
在高铵处理下,两品种TaGS1;2基因的相对表达量随处理时间的延长均呈先升后降的变化趋势,均在处理1 d后达到峰值;在高盐处理下,TaGS1;2基因的表达量随处理时间的延长在中国春中呈先降后升的变化趋势,在铜麦6号中呈“升-降-升”的变化趋势;在高铵与高盐双重处理下,两品种TaGS1;2基因的表达量随处理时间的延长均呈先升后降的变化趋势,均在处理3 d后达到峰值。三种处理下铜麦6号TaGS1;2基因的表达量均在处理1～5 d后显著高于中国春。
在高铵处理下,TaGS1;3基因的相对表达量随处理时间的延长在中国春中持续升高的变化趋势,在铜麦6号中呈“升-降-升”的变化趋势,且在处理1 d后达到峰值,在处理1～7 d铜麦6号TaGS1;3基因的相对表达量显著高于中国春;在高盐处理下,两品种TaGS1;3基因的相对表达量随处理时间的延长呈持续升高的变化趋势,在处理1～7 d后中国春TaGS1;3基因的相对表达量显著高于铜麦6号;在高铵与高盐双重处理下,TaGS1;3基因的相对表达量随处理时间的延长在中国春中呈持续升高的变化趋势,在铜麦6号中呈先升后降的变化趋势,且在处理3 d后达到峰值,在处理1 d后其表达量显著高于中国春,在处理5～7 d后显著低于中国春。
2.3.2 叶片中TaGS2基因的表达模式
从图5可以看出,在高铵处理下,中国春和铜麦6号叶片TaGS2基因的相对表达量随处理时间的延长均呈先升后降的变化趋势,分别在处理1 d和5 d后达到峰值,在处理3～5 d后铜麦6号的相对表达量显著高于中国春;在处理1 d后显著低于中国春。在高盐处理下,中国春和铜麦6号TaGS2基因的相对表达量随处理时间的延长也均呈先升后降的变化趋势,分别在处理1 d和3 d后达到峰值,在处理3～7 d后铜麦6号的相对表达量显著高于中国春。在高铵与高盐双重处理下,TaGS2基因的相对表达量随处理时间的延长在中国春中呈“降-升-降-升”的变化趋势,在铜麦6号中呈先升后降的变化趋势,均在处理3 d后达到峰值,在处理1～5 d后铜麦6号的相对表达量显著高于中国春。
3.1 高铵与高盐处理对小麦苗期生长和生理指标的影响
耐铵小麦品种具有较高的氮素利用效率和产量,可提高盐碱地的利用率,因此筛选耐铵品种具有重要意义。刘 扬等[20]和李春顺等[19]以高铵(10 mmol·L-1NH4+)条件下的小麦种子萌发率、幼苗形态、根冠比为指标,筛选出烟农19、豫麦49等耐高铵品种,以及郑引1号、镇麦9523、鲁麦15等高铵敏感型品种。本研究发现,铜麦6号表现出耐高铵和耐高盐的特性,烟农19则表现为耐高盐、不耐高铵的特性,这与李春顺等[19]的研究结果不一致,但与李德福等[21]的研究结果较为一致。与铜麦6号相比,模式品种中国春的耐高铵性与耐盐性均较低。
3.2 高铵与高盐处理对小麦苗期TaGS基因表达模式的影响
当NH4+为单一氮源时,短时间内会诱导小麦根中GS的活性增加,长时间则会抑制GS的活性[22]。高铵处理条件下,耐高铵品种由于具有较强的铵同化能力,其叶片中GS的活性和游离氨基酸含量增加,但NH4+含量降低[19]。盐胁迫条件下,小麦GS活性随着盐浓度的增加而下降,且随着盐浓度的增加,叶片中NH4+的浓度也会持续增加[7-8],因此高盐胁迫也会引起铵盐毒害。
本研究发现,小麦苗期根中3个TaGS1基因均响应高铵和高盐处理,且对高盐处理更敏感。除高铵与高盐双重处理7 d后中国春TaGS1;2的表达量显著高于铜麦6号外,其他处理铜麦6号TaGS1;2的表达量均显著高于中国春,说明铜麦6号的耐胁迫特性与TaGS1;2密切相关,这与朱忠欣[23]在水稻中的研究结果一致。原因可能是3个TaGS1基因对高铵、高盐处理的响应分工不同,TaGS1;1和TaGS1;3基因主要作用于根尖,而TaGS1;2基因在根尖和根毛区都可发挥作用[6]。
此外,高铵与高盐双重处理对小麦幼苗生长及TaGS1基因表达的抑制,并不是两种胁迫效应的简单叠加,外源NH4+也会缓解高盐胁迫(NaCl)所造成的伤害,这从另一个方面说明存在某种机制使细胞对NH4+的吸收转运与Na+的吸收有关。我们提出假设,液泡中NH4+或Na+的贮存,是耐铵盐毒害或耐盐胁迫的重要原因,植物细胞质膜和液泡膜上存在着NH4+/H+反向或同向转运体,通过改变胞内H+浓度可以调控Na+/H+-ATPase的活性,进而影响对Na+的吸收,但有待进一步试验验证。
小麦TaGS2基因与耐盐性密切相关,通过同化光呼吸所产生的NH4+,保护PSII的活性,减少电子传递所产生的超氧化物[24]。Hoshida等[9]研究表明,过表达GS2基因的水稻中,叶肉细胞NH4+和Na+的浓度与GS2的活性高度相关。本研究结果也表明,除高铵和高盐处理1 h外,其他三个处理下不同时间点,铜麦6号叶片中TaGS2基因的表达量均高于中国春,表明铜麦6号苗期叶片TaGS2基因的表达与其耐高铵和耐高盐特性密切相关。本研究在铜麦6号苗期鉴定的耐高铵和耐高盐特性,并不能代表其在分蘖期、拔节期和灌浆期的耐胁迫特性,因此后续需用盆栽或大田试验进行进一步鉴定,并对胁迫条件下TaGS基因的表达模式及功能进行深入研究,为选育耐高铵优良种质,提高小麦在高铵及高盐胁迫下的氮素利用效率及产量奠定基础。
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