温增欣，索全义，万宇宸，王艳红
（内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古自治区土壤质量与养分资源重点实验室，农业生态安全与绿色发展自治区高等学校重点实验室，呼和浩特 010018）
近年来，我国畜禽养殖业迅速发展，为了预防动物疾病、促进动物生长、提高养殖的经济效益，抗生素被广泛使用[1-2]。但抗生素很难被动物吸收，有30%~90%的抗生素以原形通过粪便和尿液排出体外，导致抗生素在畜禽粪便中大量残留，造成环境污染[3-5]。
畜禽粪便可通过好氧堆肥工艺进行资源化利用，堆肥过程是利用好氧微生物来降解有机物的过程，国内外已有许多学者进行了相关研究[6-7]。梁天等[8]发现堆肥C/N 为35 时的堆肥效果最好，徐宁[9]的研究指出堆肥pH 应控制在5.5~9.0。上述研究表明，适宜的温度与C/N 是堆肥正常进行的必要条件。抗生素是可以阻止其他活细胞发育的化学物质，它可以改变微生物的种类、数量以及群落结构功能，使堆肥方向发生改变，因此抗生素对堆肥过程的影响引起了关注[10]。时红蕾等[11]发现堆肥中存在的抗生素显著抑制了堆体温度的升高，增加了水溶性碳的残留，并阻碍了脱氢酶和脲酶活性。曹永森[12]也发现抗生素对堆体温度影响较大，且对过氧化氢酶、蛋白酶、脲酶、纤维素酶以及蔗糖酶的活性普遍存在抑制现象。此外，还有研究证明磺胺二甲嘧啶的存在扰乱了堆体微生物多样性，短期内延缓了堆肥进程[13]。因此，畜禽粪便中残留的抗生素会对堆体理化性质产生影响，但不同类型的抗生素对堆体产生的影响是否相同并不明确。
四环素类抗生素是畜禽养殖业中使用量最大的抗生素之一[14]，但有关四环素类抗生素对堆肥过程影响的研究相对较少，因此本研究将四环素和土霉素分别添加到畜禽粪便中，监测好氧堆肥过程中温度、pH、电导率、C/N、过氧化氢酶、脲酶等决定好氧堆肥良好运行的重要参数，为含四环素类抗生素的畜禽粪便资源化和无害化利用提供理论依据。
1.1 堆肥装置
采用自制的保温泡沫箱堆肥反应器，泡沫箱尺寸为535 mm×395 mm×400 mm，在泡沫箱侧方插入两支水银温度计，并在泡沫箱上打小孔保持通风环境。
1.2 供试材料
供试抗生素为土霉素和四环素，抗生素购于兽药店，四环素规格≥98%，土霉素规格≥50%。
堆肥原料：以风干羊粪为主材料，玉米秸秆为辅材料进行堆料C/N的调节。堆肥原料的基本性质见表1。
表1 堆肥原料的基本性质（干基）Table 1 Basic properties of compost materials（dry base）
1.3 试验设计与方法
试验在内蒙古农业大学遮雨棚进行，采用好氧堆肥的方式。每个堆肥反应器中加入10 kg 风干羊粪，每千克羊粪中加入218 g 玉米秸秆混合，调整C/N 约为30，将初始含水率调整为60%左右。四环素类抗生素添加量为10 mg·kg-1（按照各地区抽样检测平均残留水平添加，具体见表2）。根据堆肥温度变化进行翻堆。
表2 各地区抽样检测抗生素残留水平Table 2 Antibiotic residue levels in all region by sampling
试验设置添加四环素（TC）、添加土霉素（OC）和不加抗生素（CK）3 个处理，每个处理3 次重复。试验从2021 年7 月10 日至8 月13 日，共堆制35 d，于堆肥的第0、3、7、14、24、35 天，在堆体中对角线三点通体取样约200 g。取得的样品均匀混合，风干后用于各项指标的分析测定。
1.4 测定项目及方法
温度的测定使用水银温度计，每天14：00 测定堆体中层偏下点位温度及室内温度；
pH 采用pH计测定，电导率采用电导率仪测定，水土比均为10∶1；
总有机碳采用重铬酸钾容量法测定，全氮采用凯氏定氮法测定；
总腐植酸的测定采用焦磷酸钠浸提-重铬酸钾容量法；
酶活性测定参照关松荫[19]的方法，脲酶采用纳氏比色法，过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定法。
积温计算方法如下：
式中：k为堆肥第j天时堆体温度。
1.5 数据处理与分析
数据利用Microsoft Excel 2019 进行基本运算和制图，采用SAS 通过单因素方差分析法进行相同时间、不同处理间差异显著性检验，以评估Duncan 多重极差检验在0.05水平上的显著性差异。
2.1 四环素类抗生素对堆肥温度的影响
温度是影响堆肥过程的重要因素之一，它影响微生物的代谢活动及有机物的降解速率，并对堆肥的腐殖化程度起着决定性作用[20]。从图1 可知，各处理温度变化趋势基本相同，均经历升温期、高温期、降温期和后熟期4个阶段。
图1 抗生素对堆肥过程中温度的影响Figure 1 Effects of antibiotics on temperature during composting
3 个处理均经历1 d 的升温期后进入高温期（表3），CK、TC 和OC 处理均在堆肥第3天达到最高温度，分别为56、53、55 ℃。从表3可以看出，各处理的高温期持续时间表现出差异，持续时间由长到短排序为CK>OC>TC，其中，CK 处理与TC、OC 处理之间差异达到显著水平，由此可知抗生素的添加抑制了堆体温度的上升，缩短了堆体的高温期持续时间。将各处理高温期积温进行比较发现，四环素与土霉素的加入并未显著影响堆肥高温期积温的变化。在降温期与后熟期，抗生素对温度的影响较小，3 个处理温度基本一致，与CK 处理总积温相比，TC 处理显著下降49.3 ℃。由此得知，抗生素主要在堆肥前期对堆体温度产生一定程度的影响，且四环素对堆体温度的影响大于土霉素。
表3 抗生素对堆体关键温度参数的影响Table 3 Effects of antibiotics on key temperature parameters of the reactor
2.2 四环素类抗生素对堆肥过程中化学性质的影响
2.2.1 对pH的影响
pH 也是影响堆肥过程的重要因素，表4为3个处理pH 的变化趋势。抗生素对pH 的影响主要在堆肥的3~14 d，在堆肥第3 天时，CK、TC、OC 处理的pH 分别为8.65、8.60、8.55，相比CK 处理，OC 处理显著降低了0.10 个单位，TC 处理pH 有所降低，但并未达到显著水平。随着堆肥的进行，各处理pH开始上升，在堆肥第7 天时，CK、TC、OC 处理的pH 分别达到8.73、8.65、8.68，与CK 处理相比，添加抗生素处理的pH 相对较低。在堆肥第14 天时各处理pH 达到峰值，分别为9.15、9.10、8.99。与CK、TC处理相比，OC处理显著降低，降幅为0.11~0.16 个单位。14 d 后各处理间pH差异逐渐缩小，至堆肥结束时CK、TC 和OC 处理的pH 分别为8.77、8.73、8.78。上述结果表明，土霉素的添加能够轻度降低堆体的pH。
表4 抗生素对堆体pH的影响Table 4 Effects of antibiotics on heap pH
2.2.2 对电导率的影响
电导率反映了堆肥浸提液中可溶性盐的含量，与堆肥原料性质及发酵过程相关[21]。由图2 可知，3 个处理的堆体电导率均呈现先上升后下降的趋势，0~7 d 堆体电导率上升，14~35 d 堆体电导率下降。抗生素对堆体电导率的影响主要在堆肥第14 d 时，此时，CK、TC、OC 处理的电导率分别为2.94、3.83、4.74 mS·cm-1，受四环素类抗生素影响，堆体第14 天时的电导率有所增加，与CK 处理相比，OC 处理电导率增加较为明显，显著高于CK 处理1.80 mS·cm-1（P<0.05），而TC 处理电导率增加了0.89 mS·cm-1，并未达到显著水平。堆肥14 d 后，3 个处理电导率差异开始减小，直至堆肥结束时，CK、TC、OC 处理的电导率分别为4.38、4.40、4.60 mS·cm-1。
图2 抗生素对堆体电导率的影响Figure 2 Effects of antibiotics on electrical conducivity of pile
2.2.3 对C/N的影响
碳氮元素是微生物的重要能源物质，许多研究将C/N 的变化作为堆肥过程中的重要指标。四环素与土霉素的添加对堆肥过程中C/N 的影响见图3，整个堆肥过程中3 个处理的变化趋势相同，即先降低趋于稳定并在后期有短暂上升的趋势。抗生素对堆体C/N 的影响主要在堆肥的3~14 d，在堆肥3~7 d 时，CK、TC 与OC 的C/N 分 别 从26.5、27.7、27.2 降至22.5、25.2、24.4，分别下降15.1%、9.0%、10.3%。在堆肥第14 天时，CK、TC、OC 处理的C/N 分别为18.6、20.1、20.4，与CK 处理相比，四环素与土霉素的添加使堆体的C/N 增高。在堆肥第24 天时CK、TC、OC 处理的C/N 达到最低值，其比值均降至20 以下，分别为16.9、18.7、18.1。上述结果说明抗生素的添加使堆体有机质分解速率减慢。
图3 抗生素对碳氮比的影响Figure 3 Effects of antibiotics on C/N
2.2.4 对腐植酸含量的影响
腐植酸及其各组分是腐殖化过程中生成的最具代表性的次生产物，其变化与堆肥的稳定性与腐熟程度密切相关。如图4 所示，CK、TC、OC 3 个处理总腐植酸含量均呈现先下降后短暂上升的趋势，说明堆料中原本存在的腐植酸并不稳定，在前期会大量矿化分解，后期才能形成稳定的腐植酸。在整个堆肥过程中抗生素的添加并未对总腐植酸含量产生显著影响，但在堆肥前期，添加抗生素处理的总腐植酸含量相对较高，证明TC与OC处理腐植酸矿化分解较弱。在堆肥后期各处理差异逐渐减小，至堆肥结束时，腐植酸含量分别为11.5%、10.3%、11.9%。
2.3 四环素类抗生素对堆肥过程中酶活性的影响
2.3.1 过氧化氢酶
过氧化氢酶是好氧堆肥过程中的重要酶之一，与堆肥中有机质（主要为木质素）的转化速度密切相关。从图5 可以看出，在整个堆肥过程中，抗生素对过氧化氢酶产生影响的时期主要在7~24 d。在堆肥第7天时，添加抗生素处理组的酶活性相对较低，其中TC处理的过氧化氢酶活性为3.22 mg·g-1·min-1，与CK 相比显著降低0.24 mg·g-1·min-1。CK、TC 和OC 处理在堆肥第14 天时的过氧化氢酶活性分别为3.41、3.17、3.28 mg·g-1·min-1，相比CK 处理，TC 和OC 处理分别降低7.0%、3.8%，显著抑制了堆体的过氧化氢酶活性（P<0.05）。在堆肥第24天时，CK、TC、OC处理的过氧化氢酶活性分别为3.80、3.42、3.79 mg·g-1·min-1，证明过氧化氢酶活性受到了四环素与土霉素抑制，但TC和OC 处理影响程度不同，其中TC 处理显著低于CK处理，降低了10.0%，而OC 处理降低幅度较小，未达到显著水平。
图5 抗生素对过氧化氢酶活性的影响Figure 5 Effects of antibiotics on catalase activity
图6 抗生素对脲酶活性的影响Figure 6 Effects of antibiotics on urease activity
堆肥结束时，添加抗生素处理与CK 处理未产生显著变化，但TC 处理与OC 处理产生差异，TC 处理显著低于OC 处理0.24 mg·g-1·min-1（P<0.05），抑制了堆体的过氧化氢酶活性。总体来看，四环素类抗生素的添加抑制了堆肥过程中过氧化氢酶活性，且四环素和土霉素对过氧化氢酶活性的影响表现出差异，过氧化氢酶活性受四环素的影响较大。
2.3.2 脲酶
脲酶作为水解酶是堆肥过程中含氮有机物矿化的关键酶，与堆肥过程中的氮元素密切相关，其活性可以表明含氮有机物降解的速度与强度[22]。在发酵前期各处理间脲酶活性差异较小，主要在堆肥第14天和第35天时有显著影响。在堆肥第14天时，CK处理和OC 处理的脲酶活性分别为43.73、42.12 mg·g-1·d-1，TC 处理脲酶活性最高，达到62.12 mg·g-1·d-1，此时，TC 处理脲酶活性显著高于CK 处理18.39 mg·g-1·d-1（P<0.05），促进了堆体脲酶活性，OC 处理与CK 相比未达显著水平，但与TC 处理相比产生差异，TC 处理脲酶活性显著高于OC 处理，证明不同种类抗生素对堆体脲酶活性的影响有所差异。
堆肥结束时，CK、TC 和OC 处理的脲酶活性分别为22.80、40.18、43.74 mg·g-1·d-1，说明四环素类抗生素的添加促进了堆体脲酶活性，与CK 相比，TC 和OC 处理分别显著增加17.38、20.94 mg·g-1·d-1（P<0.05）。综上所述，四环素类抗生素的添加促进了堆体脲酶活性。
温度的变化反映了堆肥进程，是堆肥过程中需要监测的重要指标。本试验结果表明，抗生素对堆体温度的影响主要表现在堆肥前期，四环素和土霉素的添加缩短了堆肥高温期持续时间，添加抗生素并未对高温期积温产生显著影响，但3 个处理堆体的总积温表现出差异，其中CK处理总积温高于TC和OC处理，且与TC处理达到显著差异水平。证明四环素和土霉素的添加均能抑制堆体温度的升高。这与马骏[23]的研究结果一致，但马骏的研究中添加抗生素组温度下降得较为明显，而在本试验中抗生素组温度下降幅度较小，这可能是马骏的研究中抗生素添加量较大的原因。在堆肥后熟期所有处理均达到一个相对稳定的温度并逐渐接近室温，Sun 等[24]的研究也得到相同的结果。这是由于随着堆肥过程的进行，抗生素逐渐降解，浓度减小，对微生物活动的抑制作用减弱[25]。杨振边[26]曾指出抗生素的降解主要发生在堆肥高温期，且经过50 d堆肥处理，抗生素的去除率高达92%；
Sel-vam 等[27]也发现四环素类抗生素较喹诺酮类抗生素更容易被降解，21 d内四环素类抗生素的去除率高达100%，这为本试验结果提供了理论支撑。
试验前期pH 出现短暂的下降趋势，这是由于微生物的代谢将堆料中的糖类、淀粉等物质分解为小分子的脂肪酸，导致堆料在最初几天产生了酸化现象[28]。本研究结果表明添加抗生素处理组相比CK 处理pH 上升幅度慢，这可能是由于加入的抗生素抑制了微生物分解含氮有机物，因此产生的氨相比CK 处理较少。Liu 等[29]曾报道过抗生素可以抑制氨的释放，因此pH上升幅度低于对照处理，这与本试验结果一致。不同时期的结果表明四环素和土霉素的添加使堆体可溶性盐含量增加，推测其原因可能是由于抗生素的添加促进了硝化细菌的增殖，使堆体物料不断矿化，生成大量的NO-3促使堆体电导率增加[30]。这与李金津等[31]报道的不同添加量的抗生素并未显著影响好氧堆肥电导率变化趋势的结论相反，这可能是由堆肥材料不同导致的，李金津等采用的是蚯蚓好氧堆肥，王亚飞等[32]曾报道不同材料的畜禽粪便在堆肥过程中的各项指标变化存在明显不同。C/N 与总腐植酸的结果表明，抗生素的加入使堆体有机物分解速率减慢，并随着时间的推移影响逐渐减弱。这与李维华等[33]的研究结果相同。这与抗生素的加入使堆体中微生物代谢受到影响有关。林辉等[34]的研究表明磺胺类抗生素的添加抑制了堆体早期微生物代谢，但在14 d 内抗生素降解率高达100%，因此，抑制作用会随着时间的延长而减弱。郭梦婷等[35]的研究表明抗生素不利于堆肥过程中水分的散失，造成堆肥结束后堆体高含水率。这为本研究结果的解释提供了理论支撑。
好氧堆肥中酶促反应的速度可以揭示堆肥过程中营养物质的转化程度。从过氧化氢酶活性的结果来看，抗生素的添加抑制了堆体过氧化氢酶活性，这可能是由于抗生素抑制了微生物分泌相关酶，进而抑制了过氧化氢酶活性。本试验结果与李亚宁等[36]报道的磺胺类抗生素浓度的增加使过氧化氢酶活性显著降低的研究结果相似。而李敏清等[37]发现过氧化氢酶活性与放线菌群有显著正相关，因此，可能是抗生素的添加抑制了堆体中放线菌群的活性，使得过氧化氢酶活性降低，这也与Chessa 等[38]报道的外源四环素的添加会对土壤微生物活性产生不利影响的研究结果一致。徐晨光等[39]发现无论较高含量（>10 mg·kg-1）还是较低含量（<1 mg·kg-1）的抗生素均会显著抑制微生物活性，使微生物群落结构发生变化。添加抗生素处理的脲酶活性要高于CK 组，这可能是由于抗生素的添加刺激了有利于含氮有机物降解的微生物。这与张凯煜等[40]报道的低浓度抗生素的添加可以促进脲酶活性的研究结果相似。综上所述，四环素类抗生素的添加对堆体内物化指标产生了较为复杂的影响，物化指标与微生物活性密切相关。李文兵等[41]的研究表明评价细菌群落丰富度的Chao1 指数与腐熟度指标之间存在较强的相关性，因此，四环素类抗生素的存在可能会对堆体腐熟度与品质造成影响，王桂珍等[42]曾报道当抗生素含量高于50 mg·kg-1时会抑制堆肥过程顺利进行并影响堆体腐熟度。因此，堆体中物化指标的变化与抗生素削减规律及堆料腐熟度的关系值得进一步研究。
畜禽粪便中10 mg·kg-1四环素和土霉素的存在会显著影响堆肥过程中各项指标的变化，四环素的添加使堆体总积温显著下降49.3 ℃，有机质分解速率及矿质化过程受到一定程度影响，最高使过氧化氢酶活性降低10.0%，并促进脲酶活性增加76.2%，相比之下，土霉素对好氧堆肥过程中物化指标影响较小。因此，不同抗生素对堆肥过程产生的影响表现出差异，在堆肥过程中要严格监控堆肥指标变化情况，合理控制堆肥条件，保证堆肥发酵质量。在人为控制和管理的基础上实现预期的堆肥效果。
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