刘佳微, 曹国璠, 吴明开, 韩 雪, 刘 筱, 黄安林
(1.贵州大学农学院, 贵阳 550025; 2.贵州省现代中药材研究所/农作物品种资源研究所, 贵阳 550025;3.贵州省农业科学院科技信息研究所, 贵阳 550025)
白及(BletillastriataL.)是兰科(Orchidaceae)白及属宿根草本植物,白及具有收敛、补血、止血、消肿等功效,外敷能治创伤出血,痈肿,烫伤,疔疮等。白及中丰富的代谢产物具有多种药用价值,如甘露聚糖、菲类化合物、多糖等具有抗流感病毒活性和抗肿瘤活性、抗菌镇痛作用[1],而白及中主要成分就是白及多糖。姚李祥等[2]研究表明,尽管多糖含量与淀粉含量之间的正相关性较弱,但是由于其具有一定的统计学意义,因此可以考虑将淀粉含量作为白及质量评价的候选指标。
白及主产于贵州、安徽、云南等地,因地理环境的不同,各地所产的白及品质及化学成分会有所不同,张新秦等[3]对贵州产区的白及药材进行多糖、浸出物和总酚含量的测定,发现不同产地间的白及品质差异较大。除此之外,不同生长年限和加工方式对药材质量也会有影响[4-7]。因此,本研究比较不同产地、不同生长年限和不同加工方式的白及多糖、淀粉含量和抗氧化能力,为白及药材的生产提供理论依据。
UV-1800 PC型紫外可见分光光度计(翱艺仪器有限公司)、电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、粉碎机、离心机、水浴锅、浓硫酸、无水乙醇、总多糖含量测定试剂盒、植物淀粉含量试剂盒、总抗氧化能力(DPPH法)试剂盒、羟自由基清除能力测定试剂盒(试剂盒均购自苏州科铭生物技术有限公司)、蒸馏水、实验所用白及样品分别为来自桐梓、普安、天柱、湄潭、安龙的一年生、多年生白及。
2.1 白及样品处理
将各产地各生长年限的白及剪须根、洗净,开水煮至无白心后,取出冷却,各样品一半置于电热鼓风干燥箱内65 ℃烘干,另一半于自然光下晒干,待完全干燥,将其粉碎后备用。
2.2 多糖含量测定
2.2.1总多糖提取
取各白及粉末样品0.05 g,加入1 mL蒸馏水,充分匀浆。100 ℃水浴2 h(防止水分流失),冷却后10 000 g离心10 min,取上清0.2 mL,加入0.8 mL的无水乙醇混匀后4 ℃静置过夜,10 000 g离心10 min,弃上清,沉淀中加入1 mL蒸馏水,充分混匀溶解沉淀。
2.2.2测定步骤
(1)分光光度计预热30 min以上,调节波长至490 nm,用蒸馏水调零;
(2)冷却。于490 nm下测定吸光值A。
2.2.3总多糖含量的计算
以葡萄糖为对照,标准条件下测定回归方程为y=15.962x-0.003 7,R2=0.997 3,x为葡萄糖含量(mg/mL),y为吸光值。
总多糖含量=(A+0.003 7)÷15.962×V1÷V2×V3÷W×1 000
V1:醇沉后重新溶解后的体积;V2:进行醇沉的体积;V3:提取时加入水的体积;W:样本质量;1 000毫克到微克的换算系数。
2.3 淀粉含量测定
2.3.1淀粉提取
淀粉含量测定使用植物淀粉含量试剂盒。
(1)称取0.1～0.2 g新鲜样本于研钵中研碎,加入1 mL试剂一,充分匀浆后转移到EP管中,80 ℃水浴30 min,3 000 g,25 ℃离心5 min,弃上清。
(2)沉淀中加入0.5 mL蒸馏水,95 ℃水浴15 min(以防止水分散失)。
(3)冷却后,加入0.35 mL试剂二,25 ℃提取15 min,震荡3～5次。
(4)加入0.85 mL蒸馏水,混匀,3 000 g,25 ℃离心10 min,取上清液待测。
注:如样本为淀粉含量较高的干样,为保证充分提取,可适当减小取样量,如称取0.01～0.02 g干样。
2.3.2测定步骤
(1)分光光度计预热30 min以上,调节波长至620 nm,蒸馏水调零。
(2)工作液的配置:临用前在试剂三中加入7.5 mL蒸馏水后,缓慢加入42.5 mL浓硫酸,不断搅拌,充分溶解,4 ℃保存备用;
(3)样本测定:取0.2 mL样本和1 mL工作液至EP管中,95 ℃水浴10 min(防止水分散失),冷却至室温,在620 nm波长下测定吸光度值A。
2.3.3淀粉含量的计算
标准条件下测定的回归方程为y=5.872x-0.029 5;x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。
(1)按照蛋白浓度计算
淀粉含量=[(A+0.029 5)×V1]÷5.872÷(V1×Cpr)
(2)按样本鲜重计算
淀粉含量=[(A+0.029 5)×V1]÷5.872÷(W×V1÷V2)
V1为加入反应体系中样本体积;V2为加入提取液体积;Cpr为样本蛋白质浓度(mg/mL);W为样本质量(g)。
注意:若吸光值大于2,请将样本用提取液稀释后再测定,计算公式中乘以相应的稀释倍数。
提取液的配置:0.35 mL试剂一+1.35 mL水。
2.4 多糖总抗氧化能力(DPPH法)的测定
2.4.1总多糖提取
提取步骤见2.2.1。
2.4.2测定步骤
(1)分光光度计预热30 min,调节波长至515 nm。
(2)DPPH自由基清除能力体系见表1。
表1 DPPH自由基清除能力反应体系
表2 羟自由基清除能力反应体系
充分混匀,室温避光反应20 min,测定515 nm吸光值,ΔA=A空白-A测定
注:若A测定小于0.2,需用提取液稀释后检测。
2.4.3总抗氧化能力的计算
(1)以自由基清除率表示
DPPH自由基清除率/%=[(A空白-A测定)/A空白]×100%
(2)以标准曲线上获得的抗氧化剂Trolox的量来表示样本的DPPH自由基清除能力。
标准曲线:y=1.414 4x-0.008 1,R2=0.997 7,x:Trolox浓度(μmol/ml),y:吸光值差值ΔA。
单位定义:用从标准曲线上获得的抗氧化剂Trolox的量来表示样本的DPPH自由基清除能力。
a.按样本质量计算:
总抗氧化能力=(ΔA+0.008 1)÷1.414 4×V样÷(V样÷V样总×W)
b.按样本蛋白浓度计算
总抗氧化能力=(ΔA+0.008 1)÷1.414 4×V样÷(V样÷V样总×Cpr)
c.按细胞计算
总抗氧化能力=(ΔA+0.008 1)÷1.414 4×V样÷(V样÷V样总×细胞数量(万个))
d.按液体体积计算
总抗氧化能力=(ΔA+0.008 1)÷1.414 4
V样总为加入提取液体积;V样为反应中样品体积;W为样品质量(g);Cpr为样本蛋白浓度(mg/mL)。
2.5 羟自由基清除能力的测定
2.5.1总多糖提取
提取步骤见2.2.1。
2.5.2测定步骤
(1)分光光度计预热30 min,调节波长至510 nm,蒸馏水调零
(2)操作表(在EP管中进行)
混匀,37 ℃保温20 min,测定510 nm处吸光值,对照管、空白管和测定管的吸光值分别记为A对、A空和A测。
注:空白管和对照管只需测定一次。
2.5.3羟自由基清除能力的计算
羟自由基清除率/%=[(A对-A测)/(A对-A空)]×100%
2.5.4数据处理
采用 Excel 2010、SPSS 22.0和origin 2018软件进行数据的处理分析和绘制图表
由图1可知,各产地白及块茎的总多糖含量和淀粉含量不同,5个产地的总多糖含量由大到小依次为桐梓、安龙、普安、天柱、湄潭,其中,桐梓和安龙白及块茎总多糖含量差异不显著且相较其他产地具有一定优势,分别为708.02 mg/g和632.09 mg/g。此外,普安和天柱白及块茎中总多糖含量也较高,而湄潭的白及块茎中总多糖含量最低,为331.46 mg/g。
图1 不同产地白及总多糖和淀粉含量
通过对比各产地的淀粉含量,从大到小依次为安龙、桐梓、天柱、普安、湄潭,发现安龙的白及块茎中淀粉含量为498.77 mg/g,显著高于其他产地,湄潭的淀粉含量最低,为199.75 mg/g。
图2可知,通过测定白及块茎中多糖的总抗氧化能力,发现不同产地的抗氧化能力也不相同,DPPH自由基清除率从大到小依次是桐梓、安龙、普安、天柱、湄潭,安龙、普安、桐梓这几个地方差异不显著,与其他几个地方差异显著,而羟自由基清除率从大到小为普安、桐梓、安龙、天柱、湄潭,其中,普安和桐梓这两个地方差异不明显。
图2 不同产地白及的抗氧化能力
白及由于受到不同产地温度、湿度、气候、地域等因子的影响,在总多糖、淀粉含量和抗氧化能力方面存在一定的差异性。桐梓地处亚热带季风湿润气候区,四季分明,气候温和湿润,雨量充沛,日照充足,无霜期长,推测基于桐梓特殊的地理位置和气候条件等,其白及的品质较优。
从图3可以看出,一年生和多年生白及的各物质含量差异显著,总多糖含量和淀粉含量随种植年限的增加整体呈降低的趋势,一年生白及块茎的总多糖和淀粉含量较高,分别为596.81 mg/g、409.28 mg/g。
图3 不同年限白及总多糖和淀粉含量
图4 不同年限白及的抗氧化能力
从抗氧化能力看来,一年生白及和多年生白及的抗氧化能力差异并不显著,但一年生白及的抗氧化性较多年生较高。
综合看来,一年生白及无论是在物质含量上还是在抗氧化能力上都比多年生白及好。白及作为多年生草本植物,推测其随着种植年限的增加,土壤中的理化性质在发生变化,导致白及块茎中有效成分的含量会受到一定的影响。
由图5可知,烘干和晒干后的白及块茎总多糖含量差异显著,且晒干后的白及总多糖含量较高,为605.18 mg/g,而这两种加工方式对其淀粉含量影响不大。
图5 不同加工方式白及各物质含量
由图6可知,烘干和晒干后的白及的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率之间差异不显著。
图6 不同加工方式白及抗氧化能力
白及药材分布较为广泛,相关文献报道,植物次生代谢产物的合成和积累受产地、品种、基因等多个因素的影响[8],通过本研究发现,不同产地白及的多糖、淀粉含量不同,说明白及中有效成分的积累与产地有着较大的关系。同时,5个不同产地的白及块茎中的总多糖均表现出不同的抗氧化活性,但其抗氧化能力都比较低,推测多糖可能不是白及中主要的抗氧化物质。
白及作为多年生草本植物,不同种植年限影响着中药材的药用价值[9]。实验结果表明,随着种植年限的增加,白及的多糖和淀粉含量逐渐降低,其抗氧化活性也在降低,可能是随着生长年限的增加,植物光合作用的速率下降,如气孔和非气孔限制(叶片衰老),使得单糖合成减少[10]。同时,随着种植年限的增加,土壤肥力下降,导致白及的营养吸收减少,从而影响了白及的物质积累。白及从种植到采收周期较长,而选择最佳种植年限的白及可以更加充分地利用该资源,发挥更好的药效,显著提高白及药材的质量,对白及多糖的质量控制及其临床应用提供保障。
白及在生产中常用加工方式为采收洗净煮至无白心后烘干、贮藏,不同加工方式对药材有效成分的积累也有影响[11],实验结果发现烘干和晒干后的白及多糖含量存在差异,晒干后的白及多糖含量较高,晒干成本低且耗能小,综合考虑白及的有效成分含量和抗氧化能力的差异,自然晒干后的白及块茎品质较好,烘干后的白及块茎总多糖含量降低,可能是由于长时间的低温烘干,导致多糖中的糖苷键发生断裂。本着节约资源的原则,在白及的初加工过程中,若量较少应选择晒干的方式,若量较多烘干时的温度不宜太高,且在烘干过程中应适时翻动,保证白及能够及时干燥。
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