佘 龙
(商洛市药品检验所,陕西 商洛 726099)
随着我国畜牧业规模的扩大,蛋白饲料出现短缺,而如何解决蛋白饲料短缺成为人们关注的重点[1-2]。目前,传统的方式是对秸秆、豆渣、苹果渣、马铃薯薯渣等饲料进行发酵,以降低饲料中粗纤维的含量,提高饲料中的粗蛋白含量[3-5]。研究发现,对玉米秸秆进行青贮可降解纤维素或者木质素,但直接对玉米秸秆进行青贮,会出现发酵品质不稳定,甚至出现变质。为解决该问题,往往会在发酵过程中添加一些发酵剂,如乳酸菌和碳源物质等[6-7]。通过这些发酵剂,促进微生物的生长,提升发酵过程中优势菌群的数量和发酵品质。本研究以玉米秸秆发酵为研究对象,将不同发酵剂添加至玉米秸秆中,进而分析玉米秸秆的青贮品质和微生物菌群变化,为改善发酵饲料的品质提供参考。
1.1 主要原材料
玉米秸秆(购自农户,长度为2～3 cm);植物乳酸菌(活菌数100亿CFU/g),济南荣正化工;酵母菌(99%),广西农保生物工程;纤维素酶(酶活≥30 000 U/g),南宁东恒华道生物科技;木质素酶(酶活≥20 000 U/g),南宁东恒华道生物科技。
1.2 实验方案设计
采用试验对比的方式,将试验分为三组,其中A组作为空白组,B组添加植物乳酸菌、纤维素酶和木质素酶,C组添加植物乳酸菌、酵母菌、木质素酶、纤维素酶。其中,添加比例按照每1 kg玉米秸秆中添加1 g纤维素酶和木质素酶,添加植物乳酸菌和酵母菌为0.02 g。
具体试验步骤为:首先将玉米秸秆切碎,然后添加适量的水与秸秆混匀,并控制玉米秸秆的含水量在58%～62%;混匀后,将玉米秸秆放入30 cm×45 cm的聚乙烯青贮袋中发酵,每个聚乙烯青贮袋中装600 g的玉米秸秆,以及通过真空密封方式在室温下发酵45 d;根据试验组设置3个平行试验,试验后取样,对不同试验组玉米秸秆的营养成分、微生物群落等进行测定分析。
1.3 测定指标及方法
1.3.1营养成分测定
取出三个试验组发酵后的玉米秸秆250 g,平摊在托盘中进行鼓风干燥。其中,先在105℃的温度下进行酶灭活,然后降低到65℃后继续干燥,至恒重后进行营养成分的测定,包括粗蛋白含量、粗灰分含量、干物质含量、中性洗涤纤维含量、酸性洗涤纤维含量、粗纤维含量。
1.3.2pH值与发酵品质测定
取三个试验组玉米秸秆样品10 g,加入90 mL蒸馏水在4℃的温度下浸提24 h,然后用纱布过滤得滤液,即为玉米秸秆发酵样品的浸提液。分别对浸提液的pH值、乳酸(LA)含量、丁酸(BA)含量、丙酸(PA)含量、乙酸(AA)含量、铵态氮含量进行测定。其中,pH值采用酸度计测定,采用苯酚-次氯酸钠比色法测定发酵玉米秸秆中的氨态氮含量,其余用高效液相色谱法测定上述酸的含量。
1.3.3微生物多样性测定
取三个试验组玉米秸秆样品10 g,然后通过DNA提取试剂盒提取微生物组的DNA;测定DNA的纯度和浓度后,进行琼脂糖凝胶电泳检测,采用PCR扩增细菌16S rDNA,上游引物的核苷酸序列为(5"-AACMGGATTAGATACCCKG-3"),下游引物的核苷酸序列为(5"-ACGTCATCCCCACCTTCC-3")。对扩增产物进行纯化后,并使用实时荧光定量PCR仪进行定量,将纯化的扩增产物进行等量混合,连接测序接头,构建测序文库,采用Hiseq2500测序仪上机测序[8]。
测序后,得到不同发酵剂发酵玉米秸秆的原始数据,过滤掉其中的低质量数据后进行序列拼接、序列去嵌合体等处理,得优化后的序列[9]。对优化后的各组样品序列进行一致性检验,聚类得操作分类单元(OTU),然后通过Omicsmart在线平台分析微生物相对丰度,并进行Alpha多样性分析、OTU分析和微生物群落结构分析[10]。
1.4 统计学分析
实验数据采用Excel软件进行整理后,通过SPSS19.0进行分析,结果用“均值±标准差”表示;以P<0.05为显著差异,具有统计学意义。
2.1 不同发酵剂对发酵玉米秸秆营养成分的影响
不同发酵剂的玉米秸秆营养成分见表1。
表1 不同发酵剂的玉米秸秆营养成分
由表1可知,与A组空白组相比,B组和C组发酵玉米秸秆的干物质、粗蛋白、粗脂肪含量显著提高;B组和C组发酵玉米秸秆在粗纤维质量占比、酸性洗涤纤维质量占比、中性洗涤纤维质量占比等方面,相比于A组空白组显著降低。
2.2 不同发酵剂对玉米秸秆发酵品质的影响
不同发酵剂的玉米秸秆的发酵品质测定结果见表2。由表2可知,C组发酵的玉米秸秆品质最好,其中乳酸和乙酸含量显著提高,且铵态氮/全氮的比值降低。
表2 不同发酵剂的玉米秸秆的发酵品质
2.3 不同发酵剂的发酵玉米秸秆微生物多样性
2.3.1Alpha多样性分析
对三组发酵玉米秸秆进行Alpha多样性分析,其结果见表3。由表3可见,三组的覆盖度均大于0.99。相比于A组,B组、C组的Simpson指数降低,说明玉米秸秆发酵饲料中的菌群多样性降低;Ace指数和Chao指数降低,说明玉米秸秆发酵饲料中的菌群丰度降低,这是由于添加的植物乳酸菌、酵母菌的生长,影响了发酵体系中的微生物体系,抑制了一些微生物的生长。由此可以得出结论,在玉米秸秆发酵过程中添加植物乳酸菌、酵母菌、纤维素酶和木质素酶对微生物的菌群多样性产生影响。
表3 不同发酵剂的发酵玉米秸秆饲料Alpha多样性
2.3.2微生物群落结构分析
通过测定,得到A组空白组的优势菌群所在属主要包括魏斯氏菌属、肠球菌属、乳杆菌属,属的相对丰度依次为58.24%、17.26%、6.13%,B组(添加纤维素酶和木质素酶)优势菌群所在属主要包括肠球菌属、魏斯氏菌属、乳杆菌属,属的相对丰度依次为40.17%、35.19%、12.64%;C组(植物乳酸菌、酵母菌、纤维素酶和木质素酶)的优势菌群所在属主要包括肠球菌属、乳杆菌属和酵母菌属,属的相对丰度分别依次为52.56%、20.68%、9.71%。
粗蛋白含量是评价发酵玉米秸秆饲料的主要指标之一。在本试验中,B组和C组发酵玉米秸秆的粗蛋白含量在一定程度上有所增加,说明玉米秸秆发酵后其粗蛋白含量有所提高。其中B组和C组发酵玉米秸秆的干物质含量的增加主要是由于发酵过程中添加了乳酸菌,产生了乳酸,抑制了杂菌的生长,在一定程度上减少了发酵过程中的干物质的损失,与学者张新平的研究结果一致[11]。
B组和C组发酵玉米秸秆的可溶性碳水化合物质量占比在一定程度上提高,是由于发酵过程中酵母菌和乳酸菌的增殖,提高了发酵品质。
B组和C组的发酵玉米秸秆的粗纤维质量占比、酸性洗涤纤维质量占比、中性洗涤纤维质量占比降低,是由于发酵过程中添加的纤维素酶和木质素酶对玉米秸秆中的纤维素和木质素进行了降解,这与任海伟等[12-13]研究结果一致,主要是因为纤维素酶的添加破坏了纤维素间的氢键,生成了单糖,也可能是由于较低的pH值造成的酸性环境促进了细胞壁成分的酸解[14]。
发酵玉米秸秆饲料发酵品质的衡量指标还包括有机酸和pH值。B组和C组的发酵玉米秸秆饲料pH值处于4.12～4.13,说明发酵玉米秸秆饲料的品质较好;B组(添加植物乳酸菌、酵母菌和纤维素酶)和C组(植物乳酸菌、酵母菌、纤维素酶和木质素酶)均额外添加了乳酸菌,乳酸菌发酵过程中产生乳酸,所以发酵玉米秸秆饲料的乳酸含量高,口感好。其中,C组的乳酸含量最高,说明植物乳酸菌和酵母菌在发酵过程中可能存在协同增强作用;同时丁酸的含量越高,说明发酵玉米秸秆的品质愈加不好,但是各组均未检测出丁酸,说明发酵玉米秸秆的品质好;铵态氮/全氮的比值代表了发酵玉米秸秆饲料中的铵态氮的含量,各组的铵态氮/全氮的比值低说明发酵玉米秸秆饲料的品质好。B组和C组的铵态氮/全氮的比值显著低于A组空白组,这主要是A组在玉米秸秆发酵过程中未额外添加菌株和酶类,且发酵过程中产生的有害微生物较多,从而产生的铵态氮多。
在微生物多样性方面,由于发酵过程中的微生物体系比较复杂,各种微生物共存,微生物的多样性和属的丰度直接影响着玉米秸秆的发酵品质和营养成分。研究过程中,对添加不同发酵剂组的微生物Alpha多样性和属水平的相对丰度进行了研究。Alpha多样性分析的覆盖度均在0.99以上,可知发酵过程中发酵剂的添加对微生物的群落结构确实产生了影响。B组和C组的乳酸菌成为优势菌群,产生乳酸的能力强,进一步抑制了玉米秸秆发酵过程中有害微生物的繁殖。
本研究通过添加不同的发酵剂发酵玉米秸秆,得到在发酵玉米秸秆中添加植物乳酸菌、酵母菌、纤维素酶和木质素酶的发酵效果最佳,发酵玉米秸秆的营养价值高,发酵品质好。
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