王芬, 吴婷*, 张萍, 张强, 刘丽
1. 贵州省黔西南州晴隆县林业局, 贵州 晴隆 561400；
2. 新疆农业大学林学与风景园林学院, 新疆 乌鲁木齐 830052；
3. 新疆林业科学院经济林研究所, 新疆 乌鲁木齐 830000；
4. 宜宾职业技术学院, 四川 宜宾 644003
核桃（Juglans regiaL.）是我国分布最为广泛的经济树种之一[1]，种植核桃已经成为地方农业农村经济发展、实现脱贫致富的支柱型产业。核桃是一种集多种营养要素于一身的优良特色干果和油料树种，也是我国重要的“木本粮油”战略树种[2]。核桃果实外部的硬壳实际上是核桃果实的内果皮，近年来早实薄壳核桃主栽品种在生产上均出现内果皮发育不完全、果仁外露、缝合线不紧密等诸多问题，严重地影响了核桃内外观品质、贮运性和商品价值。收集国内外相关文献资料，进行归纳、总结和比较分析，对目前核桃内果皮发育的研究成果进行综合和梳理，为生产实践中制定合理的繁育管理措施、减少露仁、裂果等的发生提供基础参考资料，也可为深入开展核桃硬壳形成机制的研究打下一定的理论基础。
目前在核桃良种选育、优质高效栽培方面急需进行的工作之一就是了解核桃坚果硬壳发育的过程及其影响因子。当前针对这些问题，主要集中在核桃坚果内果皮发育的影响因子、核桃内果皮发育与木质素代谢的关系、麻核桃不同发育程度与核桃内果皮主要成分的关系和核桃木质素代谢过程中相关基因克隆与表达分析等方面。相关科研人员研究发现：在内果皮厚度与种仁品质相关性分析中，种仁品质随着内果皮厚度的增大而明显增加，而出仁率随着内果皮厚度的增大而明显减少[3]。不同核桃品种内果皮厚度存在着一定的差异性，缝合线紧密度越高其内果皮就越厚，而其裂果率和虫果率就越低，在初加工过程中清洗的污染率就随之下降[4]。由此可知，核桃内果皮在其外观品质及经济效益上起着重要作用。
核桃的果皮由内、中、外3 层组成[5]，核桃内果皮为坚硬的核壳，其结构相对复杂，由多层薄壁组织构成，前期细胞体积小、排列紧密，后期木质化形成石细胞层；
中果皮主要由两层石细胞和薄壁组织构成，外果皮由薄壁组织和表皮层组成。
核桃坚果成熟的整个过程是从雌花柱头枯萎开始至青皮变黄开裂为止，构成整个果实的发育期[6]。核桃内果皮在发育过程中细胞木质化加厚、非常坚硬并且组织结构非常致密，其木质化主要表现在硬核期。吴国良等[7]研究表明，内果皮发育后期细胞壁增厚并迅速石细胞化，成为坚硬的果壳。李夕勃[6]研究认为在核桃果实硬核期，其内果皮的硬化是由顶部逐渐向底部进行的，核壳内隔膜与褶壁的弹性、机械强度逐渐加强，核壳表面呈现起伏状纹路且机械强度加大。
目前国内外学者认为影响核桃内果皮发育的成分主要有木质素[6,8-12]、纤维素[13-16]、棕色素[17-21]等。肖玲等[5]通过植物显微切片观察，内果皮发育也就是内果皮的薄壁细胞逐渐向石细胞分化的过程，也是细胞的次生壁形成、厚度增加并逐渐木质化的过程。植物的木质化过程是木质素在其组织中的沉积，导管壁的次生细胞壁变厚就是木质素连续沉积的结果[6,22]。而在木质化细胞中，核桃内果皮最主要的成分木质素是从细胞壁一角开始逐渐发展到初生细胞壁、次生细胞壁的生物合成活动[8]。木质素、纤维素和半纤维素是核桃内果皮的主要成分，木质素和纤维素的生物合成过程是内果皮形成的主要过程[23]。
木质素是一种高碳含量的复合聚合物，其通过共价键和氢键与纤维素、半纤维素相互交织且主要沉积在特殊细胞类型的次生壁中，使其具有刚性和防水性能。严格控制的生长程序确保了在这些特化细胞的分化过程中木质素沉积的适当时间和位置[24]。
李夕勃[6]发现18 个核桃品系间核桃内果皮中木质素含量存在明显差异；
核桃果实在发育过程中内果皮木质素含量的变化明显，从果实硬核期开始到成熟过程中木质素含量逐渐增加，木质素含量与硬壳厚度呈极显著正相关。靳丽鑫等[25]研究发现麻核桃发育非正常的内果皮较正常内果皮木质素含量严重不足，而发育非正常的内果皮较正常内果皮纤维素含量远超其上。试验结果表明，核桃中木质素和纤维素的生物合成调控机制是相互补充的，即在木质素含量不足时纤维素弥补性增加其含量。文菁等[26]研究认为在木质素的沉积和含量测定分析中，硬核初期细胞层数随着核桃内果皮木质素的沉积增加而增多，内果皮细胞层数逐渐稳定之后木质素的积累表现为次生壁增厚。纤维素的变化情况接近于木质素。而在硬核期核桃未聚集正常发育所需的葡萄糖、阿魏酸，可能是影响木质素、纤维素等形成的原因，而导致内果皮的木质化进程受到抑制[27]。陈鹏鹏[28]对波斯核桃壳厚表型的分析表明，PXC1 基因果实发育阶段的表达量的改变证明PXC1 基因可能参与调控纤维素含量的变化。
棕色素属于天然色素中的植物色素类，是坚果硬壳中不可或缺的组成成分[29]。陈志勇、李维莉等[17，30]从核桃壳中提取到耐热好、有抗氧化性能的脂溶性棕色素和有一定的耐光性和热稳定性水溶性好的棕色素。研究表明麻核桃发育不良硬壳棕色素含量远低于正常硬壳，说明棕色素对麻核桃硬壳发育有较大影响[25]。
已有研究文献中，对影响核桃内果皮发育过程中木质素合成的环境因素的研究目前主要在光照、矿质元素和外源激素这几个方面。
3.1 光照
光照对核桃生长发育、花芽分化及开花结实均具有重要的意义。结果期核桃一般要求全年日照2 000 h及以上，若低于1 000 h 则会引起内果皮和种仁发育不良。核桃坚果内果皮发育的充实度比例随着光照时间的增加而升高[31]。木质素合成与光照时间呈极显著正相关，向阳面光线充足因此木质素沉积相对背阴面较多，核桃内果皮的机械强度也随之加强[32]。李夕勃[6]研究发现同一树体不同部位果实内果皮中木质素等其他成分及与木质素相关酶活性因树体部位光照的不同而存在差异。调查结果表明，核桃树冠由于外围光照远高于内膛，因此外围果实发育不良的比例远低于内膛[33,34]。核桃果实内果皮发育过程中栽植密度小的园中木质素和多酚含量高于栽植密度大的园，且核桃坚果的品质更优[35]。
3.2 矿质元素和外源激素
靳丽鑫[36]通过施N、P、K、Ca 处理，发现坚果硬壳发育正常率的提高、木质素含量的增加与施肥量呈显著正相关。通过对麻核桃坚果硬壳主要成分间相关性分析可知：N、P 肥能使木质素含量增加，而K 肥对木质素含量的影响是先降后升的。Ca 肥对木质素合成的影响不大，但对纤维素合成的影响有一定的抑制。宁万军等[37]在核桃果实硬壳期喷施K、Zn、Ca、Mg 肥，显著提高了核桃品质并降低了露仁率。龙国辉[38]以稀释倍数为1 500 倍液的螯合钙对核桃叶面进行喷施能促进核桃内果皮木质素合成。鱼尚奇等[39]发现生长素IAA 在核桃内果皮硬化过程中发挥着重要调控作用。鹿宏丽[40]认为不同浓度GA3和IAA 处理增加了核桃果壳厚度和硬壳机械强度。
4.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）
苯丙氨酸解氨酶（phenylalaninammo-nialyase，PAL）是一个可把苯丙氨酸用于酚类化合物合成的酶。在组织中的活性可随外界因素而发生显著变化，有时还受光敏色素所支配。也是苯丙烷代谢途径中的第一限速酶，它可催化苯丙氨酸脱氨基生成反式肉桂酸[41,42]。有研究认为PAL 是木质素代谢途径的关键酶和光调控酶[43]，光照时间长的部位相对光照时间短的部位，PAL 酶活性较强，木质素沉积较多[31]。李夕勃[6]研究发现核桃硬壳在发育过程中PAL 的活性先升高后降低，之后略升高再降低，与硬壳中木质素含量呈正相关。文菁等[26]研究发现核桃硬壳发育过程中PAL 活性在硬壳分化的初期较高，之后逐渐降低，这是因为引起木质素的积累需要PAL 酶活性达到一定的水平，因而出现了在木质化之前PAL 酶活性相对较高。郭永翠等[44]研究发现，露仁核桃‘温138’前期PAL 基因表达远低于后期表达，可能是前期木质素代谢中间产物形成太少、木质素积累不足的缘故而导致核桃内果皮发育不完全。
4.2 多酚氧化酶（PPO）
多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）常会引起植物发生褐变，原因是与底物接触而发生的氧化还原反应，在有氧的条件下使酚类物质形成醌类物质，从而生成黑色素并引起植物褐变。李夕勃[6]、靳丽鑫等[25]、文菁等[26]研究都发现在核桃硬壳的发育过程中PPO 活性在各个发育时期变化较小，认为虽然PPO 活性的增强能够促进核桃硬壳木质素的生成，但并不起主要作用。
4.3 过氧化物酶（POD）
过氧化物酶（peroxidase，POD）在植物生长发育过程中其活性是连续变化的，且活性比较高。它与光合作用、呼吸作用等都有一定的关系。因POD能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，从而使木质化程度上升[45]。李夕勃[6]研究发现相关酶POD 在核桃硬壳发育过程中活性较低，且相关酶POD 活性变化与木质素含量变化呈极显著负相关。文菁等[26]研究发现核桃硬壳发育过程中POD 活性在硬壳分化初期较高，后逐渐降低，是因为引起木质素的积累前提是POD 酶活性需达到一定水平才能实现这一生物合成活动。靳丽鑫[36]研究发现POD 在硬核期间变化比较平稳甚至在前中期略有下降，认为POD 与木质素和纤维素的合成无明显关系。这几个研究结果存在一定的差异，需后续进一步研究。
4.4 其他相关酶（基因）
肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）在单木质素生物合成的最后步骤之一中起作用，在聚合成木质素聚合物之前将肉桂醛催化还原成肉桂醇。一般而言，CAD 的转基因下调不会影响总木质素含量，但是对木质素生物合成的抑制会导致木质素组成的变化[46]。在拟南芥CAD 双基因突变体中，相比于野生型突变体成熟茎中木质素含量降低了40%。引起了其茎秆木质素结构的改变[47]。汪灿等[48]的研究结果显示，荞麦品种中木质素含量高的茎秆，其CAD 活性相对增强。郭永翠等[49]研究分析结果发现,核桃硬化过程中CAD 基因参与调控木质素合成，从而导致木质素积累的缺乏。CAD 基因家族中JrCAD17 和JrCAD18 基因的表达模式与木质素的积累存在紧密联系[50]。
4-香豆酸辅酶A 连接酶（4-coumarate:coenzyme A ligase EC6.2.1.12，4CL）是木质素合成途径中的最后一个关键酶，4CL 是起到连接木质素前体及各个分支反应作用的关键限速酶,在木质素生物合成途径中4CL 分别催化对-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸生成相应的辅酶A 酯,促进木质素单体的合成[51,52]。早期研究发现，在拟南芥、烟草转基因植物中4CL酶活性的提高能促使木质素含量的增加，并且其茎显示异位木质素分布。而抑制4CL 酶活性导致木质素含量降低，其茎中的木质素分布严重减少[53,54]。有研究表明，转基因拟南芥的4CL 活性被抑制后，其中紫丁香基-木质素含量下降，愈创木基-木质素并无明显改变[55]。但是在转基因烟草中不仅这两种木质素含量都有下降，而且愈创木基-木质素下降幅度大很多[56]。郭永翠[57]相对定量分析结果发现，4CL 基因在硬壳完整核桃内果皮中的表达量远高于同期露仁核桃内果皮中的表达量，说明露仁现象可能由于硬核期缺乏木质素的积累。
肉桂酸-4-羟基化酶（Cinnamate 4-hydroxylase，C4H）是催化桂皮酸形成咖啡酸、香豆酸的酶。该酶属于细胞木质素合成途径中的关键酶。Sewalt 等[58]研究发现，C4H 活性的降低引起木质素含量显著减少而且导致木质素组成的改变。当C4H 酶的活性受到约束后，转基因烟草的木质素含量显著减少，虽然在此基础上调控C4H 酶的表达会引起木质素构成的改变，但是生长现象正常无异[59]。
香豆酸-3-羟基化酶（Coumarate 3-Hydroxylase，C3H）被认为是植物中木质素和许多其他苯丙烷途径产物的生物合成所必需的，也是催化合成双子叶植物中两种主要木质素亚基：愈创木基和紫丁香基的关键步骤[60]。其作用是催化肉桂酸向香豆酸的转化，最适催化底物是甲酰肉桂酯类化合物[61]。目前在苜蓿[62]、杨树[63,64]的研究结果中，降低C3H 基因表达会导致木质素总量的变化。
肉桂酸和对香豆酸（木质素合成中间代谢物）是Scleritic-hue 和Pulpy-hue 中木质素合成发生反常表现的化合物,它们既是木质素生物合成的关键中间物质,也是木质素生物合成过程的重要调节物[65]。
在对核桃生产栽培中出现的内果皮发育不全问题，鱼尚奇[66]等对纸皮核桃内果皮硬化期进行了转录组测序，发现候选基因参与了苯丙氨酸代谢、ABC 转运子合成等核桃内果皮硬化进程中主要涉及的生理生化过程。另有利用RNA-seq 技术，对核桃硬壳形成期内果皮的转录组进行了研究分析，丰富了核桃内果皮形成的分子机理的研究[67]。还有以‘温138’核桃为研究对象，从其内果皮中克隆到（PAL、4CL 和CCR（肉桂酰辅酶 A 还原酶））3 种基因的 c DNA 片段后对其在不同发育时期内核桃内果皮中的表达量进行分析[68]、核桃内果皮 CAD 基因克隆及其在硬化过程的表达分析[49]和从‘温 138’‘纸皮’两个品种的核桃内果皮中克隆 C3H、C4H、CCo AOMT 和F5H 四对基因，并通过实时荧光定量 PCR 技术得到，这四对基因在内果皮硬化过程中在一个时期出现表达量较低，从而导致‘温 138’核桃由于木质素前期物质积累不足所以出现露仁现象[69]。核桃露仁主要涉及苯丙烷类代谢、金属离子响应及转运等生物学过程和177 个关键基因参与[65]。
综上所述，在核桃内果皮发育过程中主要影响成分有木质素、纤维素和棕色素，影响木质素合成有环境因素、木质素合成相关酶（基因）和相关基因的克隆与表达等。众多科研学者在有关核桃内果皮发育方面做了很多的工作，尤其是近年来对核桃内果皮相关酶（基因）克隆及表达分析上有了新的进展[39,49-50,57,65]。
但是相比于其他果树、作物，在核桃内果皮发育过程中对木质素所研究的内容并不是很全面，比如在核桃内果皮发育过程中主要成分之一棕色素的研究、纤维素合成的相关因素研究及纤维素代谢过程中相关基因克隆与表达等其他相关成分的研究近些年未见进展，特别是在糖、酚、激素等方面对木质素合成的影响需要更深入地研究。
在目前研究文献中对核桃内果皮主要组成成分木质素生物合成的影响因素进行了一些研究，但由于木质素的生物合成是复杂、多途径的生化调控过程，影响其生物合成的因素也是多元化的，如在不同胁迫条件、不同栽植密度等对核桃内果皮发育的影响目前少见报道，在这些方面进行探索将对于核桃等果树在生产应用中进行良种选育和提高其果实品质等方面打下坚实的研究基础。
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