周 佳, 邱智东, 林 喆, 律广富, 许佳明, 林 贺, 王可欣, 王雨辰, 黄晓巍,3
（1. 长春中医药大学药学院临床药学与中药药理教研室，吉林 长春 130117；
2. 长春中医药大学吉林省人参科学研究院中药药理组，吉林 长春130117；
3. 长春中医药大学东北亚中医药研究院基础研究所，吉林 长春 130117）
卵巢恶性肿瘤是女性常见的生殖器官肿瘤之一［1］。由于卵巢组织结构复杂且周围神经分布少，卵巢肿瘤很难在发病早期监测到，60%以上患者发现即为晚期，导致卵巢癌的治愈率在妇科肿瘤中最低，致死率最高［2］。随着医学的进步，肿瘤的治疗呈现多样化和个体化，但在临床实践中，化疗、放疗和手术切除仍是卵巢癌的主要治疗手段，且上述方法普遍存在特异性差、不良反应严重和耐药性强等缺陷［3］。白屈菜红碱（chelerythrine，CHE）是一种由罂粟科植物白屈菜中提取的季铵型苯并啡啶类生物碱，具有抗炎、抗病毒和抗肿瘤作用［4-7］，但其对卵巢癌细胞增殖、侵袭和转移的影响及作用机制尚未完全阐明。本研究采用转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1） 诱导人卵巢癌SKOV3 细胞发生上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition， EMT）， 探讨 CHE 对TGF-β1 诱导后的SKOV3 细胞增殖、迁移、侵袭和EMT 的影响，为抗卵巢癌新药的研发提供理论依据。
1.1 细胞、药物、主要试剂和仪器卵巢癌SKOV3细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）。CHE（上海源叶生物科技有限公司，批号：B20052）。胎牛血清（澳大利亚Clark 公司），RPMI 1640 培养基（美国Hyclone 公司），TGF-β1（美国Cell Signaling公司），Transwell 小室和Matrigel 基质胶（美国Corning 公司），二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 和 噻 唑 蓝 （methylthiazolydiphenyltetrazolium，MTT）（北京索莱宝科技有限公司），E-钙黏 蛋 白 （E-cadherin）、 N- 钙 黏 蛋 白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin） 和β-肌动蛋白（β-actin）（武汉三鹰生物技术有限公司），Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔IgG （H+L） 和Alexa Fluor 647 标记山羊抗兔IgG（H+L）（上海碧云天生物科技有限公司）。超净工作台（型号：SW-CJ-1FD，苏州净化设备公司），二氧化碳培养箱（型号：MCO-17AIC，美国SANYO 公司），荧光显微镜（型号：Ⅸ73，日本Olympus 公司），蛋白电泳仪（型号：BE6085，美国Bio-Rad 公司），多功能化学发光成像仪（型号：Q9-Aliance，英国UVltec 公司）， 多功能微孔酶标仪（型号：Multiskan FC，美国Thermo 公司）。
1.2 细胞培养卵巢癌SKOV3 细胞采用含10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI 1640 培养基在37 ℃、5% CO2孵箱中培养。
1.3 MTT 法检测各组细胞增殖抑制率取对数生长期SKOV3 细胞，以1×104mL-1密度接种于96 孔细胞培养板中，24 h 后向各组加入0、2.5、5.0、10.0、20.0 和40.0 μmol·L-1CHE，每组5 个复孔，0 μmol·L-1CHE 组为对照组，孵育24、48 和72 h 后，每孔加入10 μL MTT 溶液，4 h 后弃上清，加入150 μL DMSO 充分溶解甲臜，酶标仪测定570 nm 波长处吸光度（A）值，计算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率= ［1- （实验孔A 值-空白孔A 值） / （对照孔A 值- 空白孔A 值）］×100%。
1.4 细胞划痕实验检测各组细胞迁移率取对数生长期SKOV3 细胞，以1×105mL-1密度接种于6 孔细胞培养板中，分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+5 μmol·L-1CHE 组和TGF-β1+10 μmol·L-1CHE组。对照组：无血清培养基培养；
TGF-β1 组：在细胞培养基中加入20 ng·L-1TGF-β1；
TGF-β1+5 μmol·L-1CHE 组：在细胞培养基中分别加入20 ng·L-1TGF-β1 和5 μmol·L-1CHE；
TGF-β1+10 μmol·L-1CHE 组：在细胞培养基中分别加入20 ng·L-1TGF-β1 和10 μmol·L-1CHE。干预24 h后进行实验。当细胞生长至80% 融合时，用200 μL 移液枪枪头沿小孔中轴划线，PBS 缓冲液润洗后拍照。24 h 后对同一位置再次拍照，计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h 空白面积-24 h 空白面积）/0 h 空白面积×100%。
1.5 Transwell 小室实验检测各组细胞中迁移细胞数和侵袭细胞数细胞分组见“1.4”。将消化后的SKOV3 细胞用无血清培养基重悬，以2.5×105mL-1密度接种于Transwell 小室上层，每孔100 μL；
下层分别加入含10%血清的培养基配制的TGF-β1、TGF-β1+5 μmo·lL-1CHE 和TGF-β1+10 μmol·L-1CHE，每孔500 μL。继续培养24 h后，PBS 缓冲液清洗小室，4%多聚甲醛固定细胞并用结晶紫溶液染色，棉签轻柔擦去小室上层细胞后，显微镜下观察并拍照计数。3 个随机选取视野的穿膜细胞数均值即为迁移和侵袭细胞数，代表细胞迁移和侵袭能力。其中，侵袭实验要提前将小室上层铺好Matrigel 基质胶，后续操作同上。
1.6 Western blotting 法检测各组细胞中EMT 相关蛋白表达水平细胞分组见“1.4”。将处于对数生长期的SKOV3 细胞以1×105mL-1密度接种于6 孔细胞培养板中，当细胞生长至80%融合时，弃上清，按照分组方法进行给药处理。24 h 后，用预冷的PBS 缓冲液洗涤细胞，每孔中加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液150 μL，细胞刮刀收集细胞，12 000 r·min-1离心5 min，得到含有细胞蛋白的上清液。BCA 蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白质浓度并定量。进行SDS-PAGE 电泳时，凝胶浓度为12%，每孔上样量为15 μL，电泳条件为150 V、80 min；
湿法转膜，转膜条件为200 mA、45 min。5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST 洗涤后，分别加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-actin 抗体，按照说明书比例稀释，4 ℃冰箱孵育过夜；
次日回收一抗，TBST 洗涤，二抗孵育2 h，ECL 发光液显色，多功能化学发光成像仪拍照，采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。
1.7 免疫荧光染色法检测各组细胞中E-cadherin 和N-cadherin 荧光强度细胞分组见“1.4”。将处于对数生长期的SKOV3 细胞以1×105mL-1密度接种于6 孔细胞培养板中，当细胞生长至80%融合时，弃上清，按照分组方法进行给药处理。24 h 后，PBS 缓冲液洗涤细胞，4%多聚甲醛固定细胞，并用0.1% Triton X-100 进行细胞打孔。5% BSA 封闭60 min 后，分别加入E-cadherin 和N-cadherin 抗体，按照说明书比例稀释，4 ℃冰箱孵育过夜。次日回收一抗，TBST 洗涤，Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔IgG （H+L） 孵育E-cadherin 组，Alexa Fluor 647 标记山羊抗兔IgG （H+L） 孵育N-cadherin 组，荧光二抗孵育2 h，并用DAPI 染色10 min。采用荧光显微镜对荧光信号进行观察并拍照。采用Image J 软件检测荧光强度，以荧光强度表示各组细胞中E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表达情况。
1.8 统计学分析采用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析。各组细胞增殖抑制率、细胞迁移率、迁移和侵袭细胞数及EMT 相关蛋白表达水平均符合正态分布并方差齐，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 各组细胞增殖抑制率CHE 处理24、48 和72 h 时，与对照组比较，5.0、10.0、20.0 和40.0 μmol·L-1CHE 组细胞增殖抑制率明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）。见表1。
表1 各组细胞增殖抑制率Tab. 1 Inhibitory rates of proliferation of cells in various groups(n=3，，η/%）
表1 各组细胞增殖抑制率Tab. 1 Inhibitory rates of proliferation of cells in various groups(n=3，，η/%）
*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.
?
2.2 各组细胞迁移率与对照组比较，TGF-β1组细胞迁移率明显升高（P＜0.01）；
与TGF-β1 组比较，TGF-β1+5 μmol·L-1CHE 组和TGF-β1+10 μmol·L-1CHE 组细胞迁移率明显降低（P＜0.01）。见图1 和表2。
图1 细胞划痕实验检测各组细胞划痕愈合情况（Bar=200 μm）Fig. 1 Scratch healing of cells in various groups detected by cell scratch assay（Bar=200 μm）
表2 各组细胞迁移率Tab.2 Migration rates of cells in various groups(n=3，，η/%）
*P＜0.01 vs control group；
△P＜0.01 vs TGF-β1 group.
?
2.3 各组细胞中迁移细胞数和侵袭细胞数与对照组比较，TGF-β1 组细胞中迁移细胞数和侵袭细胞数明显增加（P＜0.05）；
与TGF-β1 组比较，TGF- β 1+5 μ mol·L-1CHE 组和TGF- β 1+10 μmo·lL-1CHE 组细胞中迁移细胞数和侵袭细胞数明显减少（P＜0.01）。见图2 和表3。
图2 各组细胞迁移和侵袭情况（结晶紫，Bar=200 μm）Fig. 2 Migration and invasion of cells in various groups（Crystal violet,Bar=200 μm）
表3 各组细胞中迁移细胞数和侵袭细胞数Tab. 3 Numbers of migration and invasion cells in various groups(n=3，）
表3 各组细胞中迁移细胞数和侵袭细胞数Tab. 3 Numbers of migration and invasion cells in various groups(n=3，）
*P＜0.05 vs control group；
△P＜0.01 vs TGF-β1 group.
?
2.4 各组细胞中EMT 相关蛋白表达水平与对照组比较，TGF-β1 组细胞中E-cadherin 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01），N-cadherin 和Vimentin蛋白表达水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）；
与TGF-β1 组比较，TGF-β1+5 μmol·L-1CHE 组和TGF-β1+10 μmol·L-1CHE 组细胞中E-cadherin 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），N-cadherin 和Vimentin 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。见图3 和表4。
图3 Western blotting 法检测各组细胞中EMT 相关蛋白表达电泳图Fig. 3 Electrophoregram of expressions of EMT related proteins in cells in various groups
表4 各组细胞中EMT 相关蛋白表达水平Tab. 4 Expression levels of EMT related proteins in cells in various groups(n=3，）
表4 各组细胞中EMT 相关蛋白表达水平Tab. 4 Expression levels of EMT related proteins in cells in various groups(n=3，）
*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；
△P＜0.01 vs TGF-β1 group.
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2.5 各组细胞中E-cadherin 和N-cadherin 荧光强度与对照组比较，TGF-β1 组E-cadherin 荧光强度明显降低，N-cadherin 荧光强度明显升高；
与TGF-β1 组比较，TGF-β1+5 μmol·L-1CHE 组和TGF-β1+10 μmol·L-1CHE 组细胞中E-cadherin 荧光强度明显升高，N-cadherin 荧光强度明显降低。见图4。
图4 各组细胞中E-cadherin 和N-cadherin 荧光强度（免疫荧光，×100）Fig. 4 Fluorescence intensities of E-cadherin and N-cadherin in cells in various groups （immunofluorescence，×100）
CHE 是中药白屈菜的主要活性成分之一，具有抗炎、抗菌和抗病毒等多种药理活性［8-11］。近年来研究［12-18］显示：CHE 在抗肿瘤方面表现出很强的生物活性，可以通过不同的机制广泛地抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，在宫颈癌、肺癌和肝癌等多种常见肿瘤中可通过促细胞凋亡、改变细胞周期、诱导自噬发生和激活线粒体凋亡等多种途径发挥抗肿瘤作用。卵巢癌是女性最致命的妇科癌症之一，由于卵巢癌临床症状隐匿和早期筛查困难，易转移和复发，其5 年生存率＜50%［19-20］。虽然可以采取减瘤术结合化疗和维持治疗等综合疗法治疗卵巢癌，但多数患者会在3 年内出现复发和转移［21］。肿瘤细胞的侵袭和转移已经成为癌症患者死亡的主要因素［22］。因此，探索更多的能够有效抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭和转移的药物，可以为其治疗提供更多选择。本研究采用MTT 法检测CHE 对卵巢癌SKOV3 细胞增殖抑制率的影响，当CHE 浓度超过5.0 μmol·L-1时，SKOV3 细胞增殖抑制率呈剂量-时间依赖性升高，表明CHE 可以抑制卵巢癌细胞增殖。
在恶性肿瘤的治疗中，除抑制细胞增殖外，阻断细胞的侵袭也是预后的决定因素之一［23］。研究［24］表明：EMT 是导致卵巢癌细胞侵袭和转移的主要原因。EMT 是一种动态且可逆的分子机制，在正常生理状态下，发挥着胚胎发生、器官发育和伤口愈合等基本生理作用。当肿瘤发生时，EMT的原始功能被肿瘤细胞利用，肿瘤的侵袭能力增加［25-27］。本研究选用EMT 强诱导剂TGF-β1 诱导卵巢癌细胞发生EMT，采用细胞划痕实验和Transwell 小室实验检测CHE 处理后SKOV3 细胞迁移和侵袭能力的变化情况，结果显示：CHE 可以抑制TGF-β1 对SKOV3 的EMT 促进作用，减少迁移和侵袭细胞数，表明CHE 能够抑制卵巢癌SKOV3 细胞的迁移和侵袭。
在肿瘤EMT 的进程中，细胞形态学发生改变，失去极性、黏性和细胞间连接，上皮标志物E-cadherin 表达水平降低， 间充质标志物N-cadherin 和Vimentin 表达水平升高［28］。E-cadherin是一种钙依赖性胞间连接蛋白，在EMT 触发时，其上游的转录因子Snail、Slug 和E 盒结合锌指蛋白（zinc finger E-box binding homeobox，ZEB） 及TGF-β 均可下调E-cadherin 的表达［29］。研究［30］表明：EMT 参与癌细胞的侵袭转移级联反应，在此阶段，癌细胞将扩散到周围的基质环境中并发生内渗，通过体液循环向远处细胞转移，导致原发癌症演变为更高级别的肿瘤。因此，抑制肿瘤的EMT过程是抑制肿瘤转移的重要手段。本研究采用Western blotting 法和免疫荧光染色法检测各组细胞中EMT 主要生物标志物的表达情况，结果显示：CHE 可以通过增加E-cadherin 表达并减少N-cadherin 和Vimentin 表达，逆转卵巢癌SKOV3细胞EMT 的进程。
综上所述，CHE 能够抑制SKOV3 细胞增殖、迁移和侵袭活性，阻止或缓解SKOV3 细胞EMT的发生。本研究结果为CHE 治疗卵巢癌的研究提供了理论依据，CHE 有望作为一种新型抗卵巢癌的药物在临床中应用，但关于其具体作用机制还有待进一步研究。
利益冲突声明：
所有作者声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：
周佳参与选题、数据收集整理和论文撰写，邱智东、林喆和黄晓巍参与指导论文撰写和提供基金资助，律广富和王雨辰参与实验操作和研究过程，许佳明和林贺参与论文审校，王可欣参与论文中数据的统计学分析。
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