魏雁虹, 杨晨雪, 杨广民, 宋 帅, 李 明, 杨海娇, 魏海峰
（1. 吉林省人民医院医学检验中心，吉林 长春130021；
2. 吉林省人民医院生物治疗与基因诊断重点实验室，吉林 长春 130021）
高迁移率族框蛋白2（high mobility group box protein 2，HMGB2） 作为高迁移率族蛋白（high mobility group protein，HMG） 家族成员之一，广泛参与多种重要的核内生物学功能，包括调节DNA 复制、转录、重组和修复等［1-2］。研究［3-5］显示：HMGB2 在多种肿瘤组织中的表达均存在异常，肝癌组织中HMGB2 表达高于正常组织，并且与肝癌的严重程度和预后呈正相关关系。研究［6］表明：HMG 家族成员可能是一种新型的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）介导物，在肿瘤的侵袭和转移方面发挥重要作用。但有关HMGB2 与肝癌EMT 之间的关系尚未完全阐明。本研究拟通过体外实验，探讨采用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA） 下调肝癌细胞中HMGB2 表达对肝癌细胞迁移和侵袭的影响，并从如何调控EMT 进程的角度阐明HMGB2 的作用机制，为揭示HMGB2 在肝癌转移和复发中的作用提供新的证据。
1.1 细胞、主要试剂和仪器人肝癌LM3 细胞株（WHELAB C1010）购自上海盈湾生物科技有限公司。DMEM 高糖培养基购自德国Brand 公司，青-链霉素双抗购自美国Gibco 公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 购自美国CLARK 公司，RIPA 裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司，总RNA 提取剂（TRIzol）购自天根生化科技（北京）有限公司，逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒均购自北京全式金生物有限公司，E-钙黏蛋白（E-cadherin）、 N- 钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、蛋白激酶B （protein kinase B，AKT）和磷酸化AKT （phosphorylated AKT， p-AKT）一抗及二抗均购自美国Abcam 公司，RNA oligo 购自苏州吉玛基因股份有限公司，Lipofectamine 2000购自法国Polyplus 公司。倒置光学显微镜购自日本Olympus 公司，7500 Fast 型荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司，电泳仪购自美国Wealtec 公司，全自动化学发光图像分析系统购自上海Tanon 公司。
1.2 细胞培养LM3 细胞采用含10% FBS 和1%青-链霉素双抗的DMEM 高糖培养基于37 ℃、5%CO2条件下孵育。当细胞融合度达80%～100%时消化传代。
1.3 细胞分组和处理方法当LM3 细胞生长至对数生长期时，将细胞消化，铺于6 孔细胞培养板中。将细胞分为阴性对照组和HMGB2 RNA 干扰组（HMGB2 siRNA 组），分别转染RNA 干扰无关序列和HMGB2 siRNA。RNA 寡核苷酸（RNA oligonucleotides， RNA oligo）（GCAGUCAGCCAAAGAUAAATT） 由苏州吉玛基因股份有限公司设计并通过化学合成法合成。
转染时以Lipofectamin 2000 为载体，按照说明书进行操作。
1.4 RT-qPCR 法检测2 组细胞中HMGB2 mRNA表达水平细胞分组见“1.3”。细胞转染24 h 后，采用TRIzol 试剂（每孔100 μL） 提取细胞总RNA，逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA，采用SYBR Green 荧光定量 PCR 试剂盒进行RT-qPCR 检测，实验重复3 次。PCR 引物序列：HMGB2， F 5"-GTGAAATGTGGTCTGAGCAGTC-3"， R 5"-CCTGCTTCACTTTTGCCCTTGG-3"；
18S，F 5"-CATTCGAACGTCTGCCCTAT-3"，R 5"-GATGTGGTAGCCGTTTCTCA-3"。采用2-ΔΔCt法计算2 组细胞中HMGB2 mRNA 表达水平。
1.5 细胞划痕实验检测2 组细胞划痕愈合率细胞分组见“1.3”。取对数生长期的LM3 细胞接种于6 孔细胞培养板，24 h 后细胞汇合度达100%时，采用枪头小侧划破细胞中轴，进行转染并换液。以上实验每组重复2 次。于转染0、24、48 和72 h 时用显微镜拍摄划痕的愈合程度，计算细胞划痕愈合率，细胞划痕愈合率=（0 h 细胞划痕宽度-不同时间点细胞划痕宽度）/0 h 细胞划痕宽度×100%。
1.6 Transwell 小室实验检测2 组细胞中侵袭细胞数细胞分组见“1.3”。采用含5%FBS 的DMEM培养基将2 组LM3 细胞制成密度为1×105mL-1的细胞悬液，每个Transwell 小室上层中加入100 μL细胞悬液，小室下方加入含10% FBS 的DMEM 培养基500 μL。培养48 h 后，结晶紫染色，显微镜拍照，记录侵入小室下方的细胞数量，即侵袭细胞数。以上实验每组重复3 次。
1.7 Western blotting 法检测2 组细胞中HMGB2、EMT 相关蛋白和AKT/mTOR 通路相关蛋白表达水平细胞分组见“1.3”。细胞转染48 h 后，加入适量的RIPA 提取细胞总蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度，用SDS-PAGE 凝胶电泳蛋白，然后将蛋白转移至PVDF 膜上，用5%脱脂牛奶进行封闭后，分别加入HMGB2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、mTOR、AKT和p-AKT一抗（1：1 000），4 ℃过夜，第2 天用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，显影仪显影，拍照，分析蛋白条带灰度值，计算细胞中目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH 蛋白条带灰度值。
1.8 统计学分析采用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析。2 组细胞划痕愈合率，侵袭细胞数，细胞中HMGB2 mRNA 和蛋白表达水平，细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、mTOR、AKT和p-AKT 蛋白表达水平，均符合正态分布，以表示，2 组间样本均数比较采用两独立样本t检验，不同时间点样本均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 2 组细胞中HMGB2 mRNA 和蛋白表达水平与阴性对照组（1.00±0.04 和1.96±0.17）比较，HMGB2 siRNA 组细胞中HMGB2 mRNA 和蛋白表达水平（0.27±0.09 和1.03±0.95） 均明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。见图1。
图1 Western blotting 法检测2 组细胞中HMGB2 蛋白表达电泳图Fig. 1 Electrophoregram of expression of HMGB2 protein in cells in two groups detected by Western blotting method
2.2 2 组细胞划痕愈合率与阴性对照组比较，24、48 和72 h 时HMGB2 siRNA 组细胞划痕愈合率均明显降低（P＜0.01）。见图2 和3。
图2 细胞划痕实验检测2 组细胞划痕愈合情况(×100 )Fig. 2 Scratch healing of cells in two groups detected by cell scratch assay(×100 )
图3 2 组细胞划痕愈合率Fig. 3 Scratch healing rates of cells in two groups
2.3 2 组细胞中侵袭细胞数与阴性对照组（232.67 个±11.67 个） 比较，HMGB2 siRNA 组细胞中侵袭细胞数（8.62 个±2.52 个） 明显减少（P＜0.01）。见图4。
图4 Transwell 小室实验检测2 组细胞侵袭情况（结晶紫，×200）Fig. 4 Invasion of cells in two groups detected by Transwell chamber assay（Crystal violet，×200）
2.4 2 组细胞中EMT 相关蛋白表达水平与阴性对照组比较，HMGB2 siRNA 组细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），N-cadherin 和Vimentin 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。见图5。
图5 Western blotting 法检测2 组细胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig. 5 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of E-cadherin, N-cadherin, and Vimentin proteins in cells in two groups detected by Western blotting method
2.5 2 组细胞中AKT/mTOR 通路相关蛋白表达水平与阴性对照组比较，HMGB2 siRNA 组细胞中mTOR、AKT 和p-AKT 蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。见图6。
图6 Western blotting 法检测2 组细胞中mTOR、AKT和p-AKT 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig. 6 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of mTOR, p-AKT and AKT proteins in cells in two groups detected by Western blotting method
肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，具有发病率高、病程隐匿和预后凶险等临床特征。与肺癌、结肠癌和乳腺癌等其他恶性肿瘤比较，肝癌患者术后复发率相对更高，一般术后3 年复发率为40%～50%，术后5 年复发率达到60%～70%［7］。肝癌恶性程度较高，肝癌患者临床生存率偏低，预后较差，主要是由于肝癌容易出现复发和转移［8］。通过寻找潜在的药物新靶点实现对肝癌细胞侵袭能力的抑制，进而预防肝癌的转移和复发，是目前肝癌研究的重点。
HMG 是一种高度进化的保守核蛋白，普遍存在于所有真核生物的细胞内［9］，其家族成员HMGB2 能与DNA 结构域结合，参与DNA 核小体的稳定，可与多种转录因子如c-Myc、p21、p53 和核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB） 结合参与转录调控，同时可接受微小RNA（microRNA，miRNA）的调控，在DNA 重组、损伤修复、细胞复制和分化成熟等过程中起重要作用［10-13］。HMGB2 除了具有作为核蛋白的生物学作用外，还是一个在炎症反应和细胞分化过程中发挥功能的细胞外信号分子［14-15］，因此在肿瘤的侵袭和转移方面可能发挥着重要作用。为了研究HMGB2 在肝细胞癌中的作用及相关机制，本研究首先将敲低HMGB2 表达的RNA oligo 序列转染至肝癌细胞中，结果显示：敲低HMGB2 的肝癌细胞划痕愈合率明显低于阴性对照组，且其侵袭能力明显降低。研究［5］表明：HMGB2 高表达与肝癌病理分级和TNM 分期有密切关联。越来越多的研究［16-18］也已经证实：HMGB2 与癌症患者的不良预后有关，其高表达加速了癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭，敲低HMGB2 表达则可导致相反结果。HMGB2 是一种肿瘤转移促进基因，因此已成为非常有潜力的肿瘤早期诊断、预后评估和耐药监测方面的标志物，也有研究者［10，19］将其作为对抗癌症复发及转移方面药物治疗的靶点。
EMT 是上皮细胞通过特定的程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，赋予了细胞较高的迁移、侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力。因此，HMGB2 可能通过EMT 途径促进肝癌细胞迁移和侵袭。本研究对细胞中EMT 相关蛋白进行检测，结果显示：HMGB2 siRNA 组细胞中E-cadherin蛋白表达水平升高，N-cadherin 和Vimentin 蛋白表达水平降低，与EMT 受到抑制后的趋势相同，即HMGB2 高表达可以促进EMT 的发生，下调HMGB2 表达可以逆转该过程。
AKT 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是许多信号通路的关键组成部分，mTOR 是AKT 磷酸化的重要下游效应分子，也是控制细胞生长、增殖和存活及基因组稳定性、葡萄糖代谢和新生血管的效应因子，AKT/mTOR 通路相关蛋白表达水平变化是EMT 发生的基础［20-22］。ZHU 等［23］研究发现：异牡 荆 素 可 通 过 磷 脂 酰 肌 醇 3- 激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）/AKT/mTOR 信号通路调节细胞凋亡和EMT，从而抑制人类结肠癌细胞的生长。LUO 等［24］研究发现：YTHN6-甲基腺苷（m6A） RNA 结合蛋白1［YTH N6-methyladenosine （m6A） RNA binding protein 1， YTHDF1］通过激活 PI3K/AKT/mTOR 信号通路促进肝细胞癌细胞生长，并通过激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路和诱导EMT 促进肝细胞癌进展。以上研究均证实：AKT/mTOR是导致EMT 发生的重要通路，是癌细胞迁移和侵袭能力提高的重要机制之一。本研究结果显示：下调HMGB2 表达后，肝癌细胞中p-AKT 和mTOR蛋白表达水平均明显升高，提示HMGB2 对肝癌细胞EMT 进程的影响同样是通过AKT/mTOR 途径实现的。
本研究初步证实了降低HMGB2 的表达能够抑制肝癌细胞侵袭和迁移，并且能够通过AKT/mTOR 通路抑制肝癌细胞EMT 发生。但本研究还存在一定的局限性：由于实验条件限制并没有建立HMGB2 过表达组，通过增加HMGB2 的表达对肝癌细胞的影响尚不清楚，尚未确定HMGB2 与AKT/mTOR 信号通路蛋白之间的关系。
利益冲突声明：
所有作者声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：
魏雁虹参与实验设计、论文起草和论文撰写，杨晨雪参与实验研究、数据处理和统计学分析，杨广民参与论文审校和学术指导，宋帅、李明和杨海娇参与数据采集和整理，魏海峰参与课题指导、论文审阅和论文修订。
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