潘栋辉 徐宇平 王辛宇 王立振 严骏杰 施冬健 杨 敏＊, 陈明清＊,
(1江南大学化学与材料工程学院，合成与生物胶体教育部重点实验室，无锡 214122)
(2江苏省原子医学研究所，国家卫生健康委员会核医学重点实验室，江苏省分子核医学重点实验室，无锡 214063)
随着经济和工业的快速发展，空气污染引起了公众的广泛关注。其中，直径小于2.5 μm 的颗粒物(particulate matter 2.5，PM2.5)已成为最重要的污染物，引起了广泛关注。PM2.5由固体和液体颗粒的空气悬浮混合物组成，其特点是粒径小、比表面积大和毒素吸收能力强。其可以渗透到人体肺部，并导致许多健康问题，如哮喘、肺炎、中风、慢性支气管炎和心律失常等[1-4]。研究PM2.5对健康的威胁及其引发各类疾病的机制，对于防治污染、应对污染造成的公共卫生事件、开发防护器具、治疗由其引发的疾病均具有重要意义。
目前，针对PM2.5对机体器官的毒害研究局限于离体的细胞、组织水平[5-10]。尽管实验结果令人鼓舞，但仍缺乏系统和全面的研究来评估PM2.5的体内行为。尤其是PM2.5如何通过气道进入人体，在支气管、肺泡组织中的滞留时间与累积量有多少，又是如何进入血液循环到达全身各组织器官的，其携带的有机碳、重金属、放射性等污染在体内是如何释放或排泄的，在蓄积部位是如何诱导疾病发生的，发生前后是否可以通过防护以改善或避免等等，这一系列科学问题还未阐释清楚。
运用分子影像技术可以轻松解决该问题。正电子断层扫描(positron emission tomography，PET)成像是临床应用最成熟的分子影像技术，具有灵敏度高、分辨率优的特点，不仅可无创、实时、连续、定量、定位监测活体状态下生理、病理变化，还是动物体内“暗箱”过程可视化的极佳工具[11-13]。活体PET显像将为揭示PM2.5诱导的病理毒理机制提供有效、客观、真实的数据。
合适的放射性核素和粒子是活体追踪PM2.5的关键。天然PM2.5难以收集并进行核素标记。我们曾对二氧化硅颗粒进行131I标记，以期作为PM2.5模拟粒子进行活体单光子发射计算机断层扫描(singlephoton emission computed tomography，SPECT) 研究[14]。但该颗粒与131I 核素的螯合效率较差，需耗时多日(约10 d)才能获得稳定的标记产物。黑色素纳米颗粒(melanin nanoparticle，MNP)是一类由天然黑色素聚合形成的纳米材料，具有广谱的光学性质[15-19]。MNP 结构以吲哚环为主，C、H、O 为其主要组成元素，可模拟PM2.5中的有机碳组分。此外，MNP易与金属核素螯合形成稳定的金属核素标记纳米颗粒。因此，MNP是PM2.5的理想模拟粒子前体。
68Ga 是临床广泛使用的正电子显像核素，其物理半衰期为67 min，可通过稀盐酸淋洗锗镓发生器(68Ge-68Ga)方便获得，无须使用昂贵的回旋加速器生产，具有核素性质优良、来源方便、标记便捷等优势[20-23]。68Ge-68Ga 发生器可24 h 内多次使用，4 h 以上淋洗可使放射性活度恢复至94%以上，这有利于重复核素标记与PET成像。
前期研究发现MNP 与金属直接接触会产生沉淀，为防止MNP 携带放射性金属核素时出现沉降，本研究拟先对MNP 进行聚乙二醇(PEG)修饰得到PEG-MNP，随后将其与68Ga3+离子进行螯合，制备得到68Ga 标记的PM2.5模拟粒子前体68Ga-PEG-MNP。鉴于PM2.5以雾化粒子形式悬浮于空气中，为了更好地模拟PM2.5，我们随后对68Ga-PEG-MNP 进行雾化，制备得到放射性68Ga 标记的PM2.5雾化粒子。经气管喷雾使其进入小鼠体内，使用小动物正电子发射断层成像(MicroPET)进行小鼠全身PET 成像，评估该雾化粒子在活体内生物分布、滞留、代谢等行为，以期阐明PM2.5经肺吸入体内后的药代动力学特性，为研究PM2.5污染对人体的危害，以及防治其所造成的健康危害提供借鉴与指导。
1.1 材料及仪器
MNP 购自美国Sigam 公司，氨基化聚乙二醇(NH2-PEG2000)购自北京键凯科技股份有限公司，其他化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。化合物的粒径和形态分别使用粒度分析仪(ZetaSizer Nano-ZS，Malvern，UK)和透射电镜(transmission electron microscope，TEM，FEI-Tecnai G2 20，USA，200 kV)进行测定。采用电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometer，ICP-MS，Agilent，USA)测定Ga3+与PEG-MNP 的负载效率。采用BioScan 公司的放射性薄层扫描仪进行放射性样品薄层扫描(thin-layer chromatography，TLC)分析。放射自显影使用Cyclone 磷屏成像系统(美国PerkinElme 公司)测定。应用德国SIEMENS 公司Inveon MicroPET 扫描仪进行MicroPET 成像。使用德国百瑞3305 型雾化器进行雾化给药。雾化粒径采用光学气溶胶粒径谱仪(SND-3100，山东诺方)测定。68Ga 溶液通过德国ITG 公司68Ge-68Ga 发生器获取。Balb/c 小鼠购自常州凯文斯动物有限公司。所有动物实验均经江苏省原子医学研究所动物实验伦理委员会批准。
1.2 PEG-MNP的制备
参考文献报道的方法制备MNP[15]。过程简介如下：取20 mg 黑色素颗粒溶解于10 mL 0.1 mol·L-1NaOH 溶液中，在强超声的条件下，快速加入7 mL 0.1 mol·L-1HCl，将反应液的pH 值调至7。所得粗产品经过30 kDa超滤管纯化，冻干得MNP。
将50 mg NH2-PEG2000溶于10 mL 去离子水中，调整pH=9。而后加入到MNP(1 mg·mL-1)溶液中，室温反应12 h 后，采用Amicon 滤器(截留分子量：30 kDa)纯化，离心，超纯水洗涤，去除未结合的PEG。收集纯化产物，冻干得黑色颗粒PEG-MNP。测定PEG-MNP的粒径、形态。
1.3 Ga-PEG-MNP的制备
取PEG-MNP 的磷酸盐缓冲溶液(PBS，1 mL，2 mg·mL-1)至反应瓶中，加入1 mL 1 mg·mL-1氯化镓的0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液。调整pH=5 后在37 ℃反应30 min。采用PD-10 脱盐柱纯化，收集产物，冻干制得Ga-PEG-MNP。采用粒径分析仪测量产物尺寸，并用TEM观察其形态。
取1 mL 1 mg·mL-1的PEG-MNP(分子量按40 000 估算)水溶液，分别加入4、20、40、80 μL 8.8 mg·mL-1的氯化镓水溶液，其中MNP 与Ga3+离子的物质的量之比分别为1∶10、1∶50、1∶100 和1∶200。MNP 与Ga3+在37 ℃反应30 min后，用30 kDa超滤管离心纯化，去离子水清洗3 次，取内管产物冻干得Ga-PEG-MNP，采用ICP-MS 测定Ga3+与PEG-MNP 的负载效率。
1.4 68Ga-PEG-MNP的制备
取新鲜淋洗的68Ga(185 MBq)盐酸溶液至反应瓶中，加入1 mol·L-1醋酸钠溶液调节其pH 至3～4。随后，加入5 mL 1 mg·mL-1PEG-MNP 溶液，37 ℃下孵育20 min(图1)。反应结束后使用30 kDa 超滤管离心除去未反应的游离68Ga3+。利用TLC 测定放射化学纯度(RCP)。其中，玻璃纤维色谱纸为固定相，甲醇、水体积比为85∶15 的溶液为流动相。68Ga-PEG-MNP 和游离68Ga3+的相对保留值分别为0～0.1和0.9～1.0。
图1 68Ga-PEG-MNP螯合标记示意图Fig.1 Scheme of 68Ga-PEG-MNP chelation labeling
1.5 68Ga-PEG-MNP的体外稳定性研究
取3.7 MBq68Ga-PEG-MNP 生理盐水溶液分别置于0.5 mL PBS 溶液和0.5 mL 小鼠血浆中，于37 ℃下放置0.5、1、2 h后分别采用TLC测定RCP。
1.6 MicroPET显像
将小鼠固定于密闭饲养箱中，头部与硅胶面罩贴合。该面罩通过软管与雾化器连接。取37 MBq68Ga-PEG-MNP 的生理盐水溶液注入雾化器中。68Ga-PEG-MNP颗粒经雾化后由小鼠气管进入体内。
小鼠给药后将其置于MicroPET 扫描床上，使用异氟烷进行麻醉。调整位置使其位于视野中心。分别于给药后第10、30、60、120、240 min进行10 min静态扫描，采集模式为三维模式，能峰为511 keV，时窗为3.432 ns。采用三维有序子集期望最大化(3D OSEM)算法进行图像重建。应用ASIPROV 软件勾画肺、肝和肾等器官为感兴趣区，计算各组织放射性摄取值(%·g-1)。
1.7 离体放射自显影
小鼠MicroPET 成像后经异氟烷麻醉处死并解剖。肺组织取出后立即进行冷冻切片。将不同区域的肺组织切片置于放射自显影胶片上曝光1 h。采用OptiQuant软件对自显影结果进行半定量分析。
1.8 统计学分析
统计分析数据用GraphPad Prism 7.0 处理，采用非配对t检验，所有数据均以3次独立测量的平均值(±SD)表示，p<0.05表示有统计学意义。
2.1 PEG-MNP的表征
NH2-PEG 通过氨基与MNP 表面的二羟基吲哚/吲哚醌基反应[19]，在碱性条件下室温反应12 h后，纯化，冻干，制得PEG-MNP，产率约为50%。将其配制成0.5 mg·mL-1的PEG-MNP 水溶液，肉眼观察为澄清透明溶液。动态光散射(dynamic light scattering，DRS)结果显示PEG-MNP 水溶液的平均粒径为18.2 nm，与MNP 粒径(10.9 nm)相比略有增加且分布较窄，表明PEG-MNP 在水中分散性良好(图2A)。TEM测试结果表明PEG-MNP 颗粒呈球形(图2B)，与MNP相比形态没有明显变化[15]。
图2 PEG-MNP的DLS曲线(A)和TEM图(B)Fig.2 DLS curve(A)and TEM image(B)of PEG-MNP
2.2 Ga-PEG-MNP的表征
为了优化PEG-MNP 与Ga3+离子的螯合条件，我们通过ICP-MS 测定Ga3+与PEG-MNP 的螯合效率，结果显示，PEG-MNP、Ga3+离子在物质的量之比为1∶10、1∶50、1∶100 和1∶200 时，Ga3+离子的螯合效率分别约为60.32%、60.56%、64.66%、70.21%，这表明PEG-MNP与Ga3+有很高的螯合效率。
在pH=5 的条件下，PEG-MNP 与Ga3+离子物质的量之比为1∶50(后文如无特别说明，均指该比例)时，Ga3+离子与PEG-MNP 表面的酚羟基快速螯合形成稳定的金属配合物(图1)，反应30 min 后纯化，测得Ga-PEG-MNP 产率约为51%。DLS 结果表明Ga-PEG-MNP 的平均粒径为24.4 nm(图3A)，分散性良好。TEM显示Ga-PEG-MNP粒子呈球形(图3B)。
图3 Ga-PEG-MNP的DLS曲线(A)和TEM图(B)Fig.3 DLS curve(A)and TEM image(B)of Ga-PEG-MNP
2.3 68Ga-PEG-MNP的表征
PEG-MNP 具有良好的金属螯合性能，几乎能与正电子显像核素68Ga 发生定量反应，将68Ga 淋洗液调节至pH=3～4，加入PEG-MNP的水溶液中，搅拌反应10 min后即到平台期，放射性标记产率为95.6%±1.9%(图4A)。TLC 分析表明68Ga-PEG-MNP 的RCP大于95%(图4B)。与先前报道的放射性核素标记的PM2.5模拟粒子(131I 标记的二氧化硅颗粒)相比，68Ga-PEG-MNP 的标记工艺简便，且产率显著提高约2倍[14]。研究表明68Ga-PEG-MNP 是合适的PM2.5模拟前体，可满足动物研究需求。
图4 (A) 68Ga-PEG-MNP的标记率随时间变化图;(B) 68Ga-PEG-MNP和(C)游离68Ga3+离子的TLC图Fig.4 (A)Time-labeling yield curve of 68Ga PEG-MNP;TLC curves of(B) 68Ga-PEG-MNP and(C)free 68Ga3+
2.4 68Ga-PEG-MNP体外稳定性
68Ga-PEG-MNP 在PBS 溶液中放置2 h 后进行玻璃纤维色谱纸点样，在甲醇/水混合溶液中层析，采用TLC 检测其RCP 仍大于95%。与之相似，68Ga-PEG-MNP 在小鼠血浆中放置2 h 后，RCP 仍维持在95%左右(图5)。这些结果表明68Ga-PEG-MNP 在生理环境中具有良好的稳定性，能确保MicroPET 扫描仪采集的放射性信号源于68Ga-PEG-MNP 而非游离68Ga3+。
2.5 MicroPET显像
我们曾采用131I 标记二氧化硅颗粒(粒径约2.5 μm)混悬液模拟PM2.5粒子，将其通过气管滴注入大鼠，并尝试通过SPECT 观察该粒子在活体内的行为[14]。尽管实验结果尚可，但二氧化硅核素附载效率不高，需要投入较大剂量的核素，且该给药方法存在颗粒聚集导致分布不均匀等不足，这可能影响相关药代动力学的研究。研究表明，PM2.5主要以气溶胶的形式分散悬浮于大气之中。因此，本研究拟将68Ga-PEG-MNP 颗粒用雾化器雾化成2.5 μm 的液滴以更好地模拟自然环境中PM2.5状态。此外，雾化可使模拟粒子均匀地沉积在组织器官中，以便更准确地观测粒子在活体内的药代动力学特性，包括分布、代谢等。
目前市场在售的各种压缩空气雾化装置、超声雾化装置，甚至纳米雾化仪，其平均粒径均在5～10 μm 及以上，其中鱼跃的手持式超声雾化仪勉强能达到平均3.5 μm，而德国百瑞3305 型儿童雾化器雾化平均粒径小于2.5 μm，能够保证模拟粒子的喷雾满足实验需求。因此，我们选用该装置将68Ga-PEGMNP溶液雾化，经诺方SND-3100光学气溶胶粒径谱仪对模拟喷雾粒径进行测试，显示雾化粒径集中在2.5 μm左右，浓度约148 μg·m-3，达到中重度PM2.5污染程度(图6)，然后通过雾化进入小鼠体内。应用MicroPET观察该颗粒在活体内的药代动力学行为。
图6 模拟喷雾雾化粒径测试图Fig.6 Test chart of simulated spray atomization particle size
由MicroPET 成像可见给药10 min 后气管呈放射性浓聚，30 min 后放射性粒子由气管扩展到肺，1 h 后气管及肺双叶均可见高浓度放射性聚集，4 h后放射性信号在肺部浓聚(图7)。定量分析表明给药10 min、30 min、1 h、2 h、4 h 后气管和肺的放射性摄取值分别为(7.20±2.44)%·g-1、(4.46±1.04)%·g-1、(4.91±2.48)%·g-1、(4.71±2.39)%·g-1、(3.34±1.14)%·g-1和(17.90±3.75)% ·g-1、(18.10±4.52)% ·g-1、(19.49±6.11)%·g-1、(19.19±2.83)%·g-1、(20.87±2.40)%·g-1(图8)。研究表明放射性粒子经雾化吸入后可由气管逐步向肺部双叶区域扩散，并滞留于肺，提示肺是PM2.5靶标器官。此外，小鼠腹部器官如肠等也可见放射性摄取，提示PM2.5可能通过消化系统排泄。由于小鼠气管和食管位置接近，可能会有少量雾化后的模拟PM2.5通过小鼠的呛咳进入食管及消化系统。后续将通过改进雾化方式来改善口腔误食的情况。与离体研究相比，MicroPET 成像清晰地展示了PM2.5在活体内早期的药代动力学行为，为后续研究奠定了基础。
图7 小鼠喷雾吸入68Ga-PEG-MNP后10 min、30 min、1 h、2 h、4 h时PET成像Fig.7 PET images of mice at 10 min,30 min,1 h,2 h,and 4 h after inhalation of 68Ga-PEG-MNP
图8 定量分析不同时间点68Ga-PEG-MNP在气管和肺的摄取值Fig.8 Uptake values of 68Ga-PEG-MNP in lung and trachea at different time points by quantitative analysis
2.6 离体放射自显影
显像结束后取小鼠肺组织进行冷冻切片，进行离体放射性自显影实验。结果表明放射性信号主要在小肺叶、中肺叶和大肺叶浓聚(图9)，大肺叶放射性浓聚高于中肺叶与小肺叶，这可能与PM2.5进入肺部的扩散运动相关。
图9 小鼠喷雾吸入68Ga-PEG-MNP 4 h后肺的体外放射自显影图Fig.9 Ex-vivo autoradiograph of lung in mice at 4 h after inhalation administration of 68Ga-PEG-MNP
我们成功地制备了一种68Ga 标记MNP(68Ga-PEG-MNP)。该粒子制备工艺简单可控、标记效率高、稳定性好。雾化后的68Ga-PEG-MNP模拟喷雾粒径集中在2.5 μm左右，能较好地模拟PM2.5环境。小动物的MicroPET 成像可将68Ga 标记PM2.5模拟粒子在小鼠活体内的早期生物分布情况快速可视化。MicroPET 成像结果显示68Ga-PEG-MNP 经雾化吸入4 h后由气管逐步向肺部双叶区域动态扩散，并滞留于肺。这为PM2.5的活体代谢机制和毒理研究提供了新思路和新方法。
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