刘晓冬，韩英浩
（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）
肝癌是我国高发的、危害极大的恶性肿瘤，其死亡率居全球癌症死亡率第4 位[1]。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma HCC）是最常见的肝癌类型，约占总病例数的90%，给我国医疗带来了沉重的负担[2]。在中国，原发性肝脏肿瘤的发病率特别高，约占全球新增病例和死亡病例的50%。据报道，肝癌男性死亡率为37.5/100 000，女性死亡率为14.4/100 000，对人类健康和生命构成严重威胁[3]。目前，肝癌的有效治疗方法包括手术治疗、化疗和放疗。然而，这些疗法可能会导致一些副作用，如肾损伤和听力障碍[4]。肿瘤的基因治疗发展较快，理论和技术正在成熟过程中，逐渐被患者接受，但价格昂贵，化疗是化学治疗的简称，化疗在肿瘤治疗中的应用最广泛，需要提高治疗效果，有效地控制扩散和转移，主要因其毒副作用，限制了临床的使用。因此，迫切需要合成更加安全有效的新化合物，以减少HCC 在治疗期间的细胞毒性。因此，设计合成高效低毒的化学治疗药物有很大的意义。
细胞凋亡是化学诱导细胞死亡的一种活性形式，其特征在于有序的细胞死亡，并由线粒体功能障碍介导。在癌症治疗中，细胞凋亡作为最佳的治疗方法。通常来说，有两种蛋白参与了细胞凋亡过程，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，Bax 蛋白是活性非常强的一种促凋亡蛋白。如果能在癌细胞中显著激活这一蛋白，可实现癌细胞凋亡的控制[5]。Bcl-2 是与细胞凋亡相关的癌基因，可以通过线粒体途径参与细胞凋亡的调控，在许多人类肿瘤细胞中都存在过表达或异常表达的现象[6]。Caspase-3 也是细胞死亡机制的重要组成部分[7]。此外，细胞凋亡是从体内去除衰老细胞的常用方法，在生物体发育和组织稳态中起着至关重要的作用。大多数抗癌疗法触发细胞凋亡诱导，并调节信号通路以消除癌细胞。线粒体在诱导细胞死亡信号的整合和传递中起重要作用。因此，抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡是很好的治疗手段。
线粒体膜电位（Δμm）是线粒体内膜两侧质子分布不均所形成的电化学梯度[8]。当细胞因线粒体损伤而诱导凋亡时，其膜电位已经开始改变，膜通透性增加，跨膜电位下降[9]。用荧光探针JC1 测定Hep3B 细胞内线粒体膜电位变化，正常情况下细胞的线粒体膜电位相对较高，JC1 探针可以在线粒体基质中进行积累，累积后会形成化学聚合物，可以产生明显的红色荧光[10]。研究表明，线粒体损伤会导致细胞发生细胞凋亡，线粒体膜电位为细胞的健康和功能状态提供了有价值的指标。当线粒体发生损伤时，线粒体膜电位下降[11]。
1，4-萘醌化合物因其潜在的生物学益处，包括抗炎和抗菌活性而被广泛研究。此外，1，4-萘醌药效团表现出抗癌活性，并且是先前研究的焦点[12]。在1，4-萘醌化合物中，好多已被用于开发有效的抗癌药物。然而，这些化合物表现出高水平的细胞毒性和显著的副作用，使得它们在临床环境中作为抗癌药物的应用存在问题[13]。为了开发具有降低副作用和优化抗肿瘤作用的化合物，研究设计合成了一种新的1，4-萘醌衍生物2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮，并对抗肿瘤活性进行评价，研究在人肝细胞癌（HCC）细胞Hep3B 中的细胞毒性作用、凋亡作用、线粒体损伤的潜在机制，为抗癌药物的合成设计提供前期研究基础。
1.1 材料
人肝癌细胞系Hep3B，来自黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院干细胞与再生生物学实验室。
1.2 试剂及仪器
1，5-二羟基萘（AR 华蓝试剂），硫酸二甲酯（AR Sigma-Aldrich），N-溴代丁二酰亚胺（AR Sigma-Aldrich），甲醇钠（AR 阿拉丁），碘化钾（AR 华蓝试剂），硝酸铈铵（AR Sigma-Aldrich），以上各种试剂均为分析纯；
青霉素链霉素混合液（P/S）购自北京索莱宝公司；
DNEM/高糖培养液购自北京索莱宝公司；
胎牛血清（FBS）购自杭州四季青公司；
含EDTA 的胰蛋白酶（T/E）购自北京索莱宝公司；
细胞缓冲液（PBS）购自美国Hyclon 公司；
噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自Amresco 公司；
Acrylamide、Bis-acrylamide、Tris-base（碱）、十二烷基磺酸钠（SDS）、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）、吐温-20（Tween-20）、1 M Tris-HCl（pH=6.8）、1.5 M Tris-HCl（pH=8.8）、丽春红、考马斯亮蓝等蛋白免疫印记系统购自美国Sigma-Aldrich 公司；
电泳槽购自瑞典Bio-Sciences AB 公司；
Western blot 转膜桶购自瑞典Bio-Sciences AB 公司；
荧光化学成像系统购自GE 公司；
全自动酶标仪购自Bio Tek 公司。
1.3 化合物合成
1.3.1 中间体5，8-二甲氧基-1，4-萘醌的合成
为合成DMNQ 的衍生物，试验以1，5-二羟基萘为原料，在25 ℃弱碱性溶液的条件下，与硫酸二甲酯进行反应，使羟基甲基化得到1，5-二甲氧基萘。利用N-溴代丁二酰亚胺（NBS）的自由基反应机制进行一系列的溴化反应，并且降低了溴化反应试剂的毒性，最终得到4，8-二溴-1，5-二甲氧基萘。在甲醇钠和碘化钾的催化反应下，并以甲醇和二甲基甲酰胺混合物为溶剂加热回流约30 h，用旋转蒸发仪减压浓缩，再用乙酸乙酯重结晶得1，4，5，8-四甲氧基萘，将硝酸铈铵溶解于水中，并将其添加到含有1，4，5，8-四甲氧基萘的氯仿和乙腈的混合溶液中，并在室温下搅拌1 h。所得有机层加入氯仿和饱和盐水萃取，使其分离，再加入无水硫酸钠除去其中的水分，用旋转蒸发仪减压浓缩至残渣。所得残渣加入甲醇、加热冷却，使其重结晶，生成中间体5，8-二甲氧基-1，4-萘醌（DMNQ）。
图1 5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮（DMNQ）的合成Fig.1 Synthesis of 5，8-dimethoxynaphthalene-1，4-dione（DMNQ）
1.3.2 2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮的合成
以DMNQ 为底物，利用典型的迈克尔加成反应得到DMNQ 衍生物2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮。
图2 2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮的合成Fig.2 Synthesis of 2-（4-methoxy-phenylmercapto）-5，8-dimethoxynaphthalene-1，4-dione
1.4 细胞传代培养
将Hep3B 细胞复苏到6 cm 培养皿里，Hep3B 细胞培养在完全培养基（DMEM）中，含有10%灭活的新生胎牛血清（FBS）和1%的抗生素（青霉素/链霉素），并置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中传代培养，24 h 换液，48 h 传代。
1.5 MTT 检测细胞抑制活性
将处于对数生长期的Hep3B 细胞接种在96 孔板中，传代时对细胞进行计数，每个孔接种5 000 个细胞，并放入培养箱中培养24 h，取出96 孔板，将上清液弃掉，加入含有1% FBS 的饥饿培养液处理2 h，弃去饥饿的培养液，在试验组分别加入1 μL 化合物溶液（化合物的终末浓度分别为0.3，1，3，10 μmol·L-1），对照组加入1 μL DMSO 对照液。药物处理采用5 个浓度梯度，4 个复孔，溶剂对照也为4 个复孔。化合物处理培养24 h 后，取出96 孔板，在每个孔中加入10 μL 的MTT 染液，放入培养箱继续处理培养2 h，弃去上清，每孔加入100 μL 二甲基亚砜溶液，放入培养箱避光培养10 min 后，拿出并包上锡纸避光。用酶标仪检测OD 值，检测波长为490 nm，导出数据，根据公式计算细胞存活率，并计算半数致死浓度。
1.6 蛋白质免疫印迹分析
将细胞接种于2 个6 cm 培养皿中，每个培养皿接种8 万个细胞。放入培养箱培养24 h 后，试验组加入50 μL 化合物溶液（3 μmol·L-1），放入培养箱继续处理培养24 h，拿出细胞，吸出上清，准备泡沫盒里面放入少量液氮，将培养皿底部接触液氮，并放到-20 ℃冰箱储存。
取出冻好的细胞培养皿样品，放置在冰上，根据细胞量加入适量的蛋白质裂解液裂解，振荡混匀，每5 min 振荡一次，振荡30 min。裂解结束后放入提前预冷好的离心机中，以4 ℃、12 000 r·min-1的转速离心20 min，离心完成后，吸取上清提取细胞总蛋白并定量，准备新的离心管，标记好组别，在每个管中加入0.8 mL 的无菌去离子水、200 μL 的考马斯亮蓝和1 μL 蛋白质样品，震荡混匀，然后将样品转移到干净的比色皿中，用分光光度计检测595 nm 波长处样品的OD 值，根据公式计算出所测样品的蛋白质浓度。根据检测的蛋白浓度配置蛋白样品，根据公式计算出所配置样品需要的无菌去离子水体积、5×buffer 和蛋白样品体积。每个样品都配置好后，振荡混匀。将其放入沸水中煮5 min，样品煮好后拿出，插入冰中或放入4 ℃的冰箱内冷却。随后进行夹板制胶，待胶凝好后开始点样，每孔中加入15 μL 样品，1.5 μL 的Maker，连接电泳仪，设置电泳电压为140 V，打开循环水开关，开始跑胶。电泳结束后，将PAGE 上的蛋白转到固相载体上。连接电源在130 mA 的电流下转膜6 h。转膜结束后，NC 膜取出放入丽春红溶液中进行预染、剪膜，用TBST 缓冲液将丽春红洗净，然后加入5%的脱脂乳封闭1 h；
封闭完成后，用TBST 洗5 遍，加入一抗孵育，4 ℃过夜孵育12 h，一抗孵育完成后，回收一抗，用TBST 洗5 遍，加入5%的脱脂乳封闭10 min，加入二抗孵育2 h。用TBST 洗5 遍，洗完后利用化学发光成像系统进行照相；
照相时先在NC 膜上滴加提前配置好的显影液，并使显影液均匀地铺满NC 膜，放入化学发光成像系统中成像，导出结果，对蛋白条带进行定量分析。
1.7 线粒体膜电位检测
首先将3P 的Hep3B 细胞传至两个24 孔板中，每孔种6 万个细胞，放入培养箱培养24 h 后，加入1%FBS 培养液饥饿2 h，试验组加入5 μL 化合物溶液（3 μmol·L-1），放入培养箱继续处理培养24 h，24 h后拿出细胞，吸出上清，用PBS 洗一遍，加入JC-1 染料，37 ℃避光孵育20 min。弃掉染料，加500 μL PBS后用荧光显微镜照相。
1.8 统计学分析
采用SPSS20.0 对数据进行统计分析，数据表示为三个独立试验的平均值±标准差，P 值小于0.05 认为具有统计学意义，组间差异采用单因素方差分析。
2.1 萘醌类衍生物的结构鉴定
2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮：1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ 7.48（d，J=6.4 Hz，2 H），7.40（d，J=6.4 Hz，2 H），7.33（d，J1/49.6 Hz，1 H），7.27（d，J1/49.6 Hz，1 H），6.69（s，1 H），3.96（s，3 H），3.90（s，3 H），3.87（s，3 H）；
13C NMR（CDCl3，150 MHz）d182.15（C-1），181.93（C-4），156.57（C’-4），154.54（C-5），154.33（C-8），153.79（C-2），153.65（C-3），133.95（C’-2），132.64（C’-6），127.24（C’-1），121.46（C-7），121.21（C-6），120.76（C-10），120.06（C-9），115.83（C’-3），115.08（C’-5），57.08（C’-4，OCH3），56.99（OCH3），56.88（OCH3）；
IT-TOF/MS：m/z 378.93（m+Na）+。
为提高抗癌活性，减少1，4-萘醌的副作用，合成了2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮。以上核磁共振谱及质谱分析数据显示，获得的化合物属于目标萘醌类衍生物，并且其化学结构和分子量符合预先的合成设计，这些结果证实了新的1，4 萘醌衍生物的成功合成。化合物结构如图3所示。
图3 2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮的结构Fig.3 Structure of 2-（4-methoxy-phenylmercapto）-5，8-dimethoxynaphthalene-1，4-dione
2.2 MTT 法检测Hep3B 细胞的细胞活力
为检测萘醌类衍生物对Hep3B 细胞的毒性，以0.3、1、3、10 μmol·L-1浓度的萘醌类化合物处理Hep3B 细胞24 h，通过MTT 方法对Hep3B 细胞的细胞活力进行检测（图4）。结果显示，2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮处理Hep3B 细胞后，Hep3B 细胞活力明显下降，并且抑制作用呈浓度依赖性。
图4 萘醌类衍生物对Hep3B 细胞活力的影响Fig.4 Effect of naphthoquinone derivatives on Hep3B cell viability
2.3 2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮诱导Hep3B 细胞凋亡
为探究2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮如何导致Hep3B 细胞活力下降，试验采用蛋白免疫印迹分析方法对细胞凋亡相关蛋白进行了检测，用浓度为10 μmol·L-1的2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮处理24 h，检测Hep3B细胞凋亡信号关键蛋白。结果显示，与对照组相比，2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮处理组的凋亡相关蛋白Cleaved caspase3 表达水平明显升高，且促凋亡蛋白Bad、Bax 表达水平也显著增加（图5），说明2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮能诱导Hep3B 细胞发生凋亡。
图5 2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮诱导Hep3B 细胞凋亡Fig.5 Apoptosis of Hep3B cells induced by 2-（4-methoxy-phenylmercapto）-5，8-dimethoxynaphthalene-1，4-dione
2.4 2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮通过线粒体损伤诱导Hep3B 细胞凋亡
研究表明，线粒体损伤会导致细胞发生细胞凋亡。当线粒体发生损伤时，线粒体膜电位下降。为进一步检测2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮诱导Hep3B 细胞发生凋亡的原因，使用荧光探针JC-1 检测2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮处理后Hep3B 细胞内线粒体膜电位的变化。JC-1 是一种荧光探针，它可以在正常的线粒体基质中形成多聚体进行积累，产生明显的红色荧光，当膜电位下降时，JC-1 从线粒体中释放出来，以单体的形式存在于细胞质中，产生绿色荧光。结果显示，与对照组相比，2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮处理组红色荧光明显减弱，绿色荧光明显增强（图6），说明2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮能通过线粒体损伤诱导Hep3B 细胞凋亡。
图6 线粒体膜电位检测Fig.6 Mitochondrial membrane potential detection
1，4-萘醌一直是一个热门话题，因为其衍生物具有广泛的生物效益，包括抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗病毒和抗癌特性。然而，副作用和高毒性限制了其临床应用[14]。萘醌衍生物由于其诱导细胞周期阻滞和调节凋亡途径相关蛋白的能力，而被评估为癌症药物候选。研究发现，不同的萘醌取代基具有不同的细胞毒性活性，这似乎是由于其结构中的羟基[15]。一些研究表明，细胞凋亡在多种肿瘤细胞中受到抑制，导致肿瘤生长和对细胞毒性抗肿瘤药物的耐药性。因此，阐明细胞凋亡机制对于预防和治疗包括癌症在内的各种疾病非常重要[16]。C5 和C8 上的2，5-二羟基取代已被证明可以改善萘醌衍生物的抗癌效果，但也会导致更多的副作用和毒性。因此，合成了一种高效低毒的萘醌类衍生物2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮。MTT 法显示2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮抑制人肝癌细胞的生长，MTT 分析结果促使进一步研究细胞凋亡，以确定2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮的机制。
细胞凋亡，也称为I 型程序性细胞死亡，是最常见的靶向化疗利用的共同机制，可诱导癌细胞死亡[17]。在针对多种癌症的化疗中，细胞凋亡有助于消除不健康或受损的细胞，并维持体内平衡，1，4-萘醌衍生物可以激活细胞凋亡，在癌症治疗中有很大的潜力。阐明细胞凋亡的机制对于预防和治疗包括癌症在内的各种疾病非常重要。细胞凋亡中的线粒体信号通路Bcl-2 家族和Caspase 家族蛋白，已被证明是通过调节凋亡来决定肝癌细胞命运的生物标志物[18]。Bcl-2 家族的抗凋亡成员是线粒体凋亡途径的监护人，Bax 和Bad 作为促凋亡蛋白发挥功能。紫草素可以使黑色素瘤细胞A375－S2 的P53 蛋白表达量增加，增加的P53 蛋白激活促凋亡蛋白质Bax，进一步导致细胞线粒体大量释放细胞色素c 激活Caspase 家族蛋白，诱导细胞发生线粒体依赖的细胞凋亡。Caspase-3 是凋亡过程中最重要的末端剪切酶，也是细胞死亡机制的重要组成部分。最近的研究表明，萘醌衍生物DMNQ S-64 通过降低A549 细胞中Bcl-2 的蛋白表达和激活Caspase 途径诱导细胞凋亡[19]。同样，研究结果表明，2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮通过增加促凋亡蛋白Bad、Bax 和切割的Caspase-3 的水平诱导凋亡。总之，这些结果表明，2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮对人肝癌细胞生长的抑制作用与诱导线粒体介导的凋亡有关。
线粒体是高度调控的细胞器，负责能量生产和氧化还原稳态，是细胞内的动力车间[20]。在正常细胞中，当膜电位正常时，JC-1 会进入线粒体内，由于浓度升高而形成发射红色荧光的多聚体[21]；
在凋亡细胞中，线粒体跨膜电位会发生去极化，JC-1 会从线粒体内释放，导致浓度降低，转变为发射绿色荧光的单体形式[22]。因此，可以通过绿色和红色荧光检测线粒体膜电位的变化。试验通过JC-1 检测线粒体膜电位，用2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮处理Hep3B 细胞24 h，通过荧光显微镜检测荧光情况[23]。结果显示，药物处理组的绿色荧光高于对照组，相反红色荧光低于对照组，说明2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮通过细胞Hep3B线粒体发生损伤诱导细胞凋亡。总之，该化合物能诱导肝癌细胞凋亡，2-（4-甲氧基-苯巯基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮可能是肝癌治疗的有吸引力的候选药物。
紫草萘醌类衍生物是一种良好的抗癌药物，研究表明紫草萘醌类衍生物可以抑制Hep3B 肝癌细胞活力，通过上调Bad 和Cleaved-caspase-3、Bax 促凋亡蛋白表达水平，并且通过线粒体损伤来诱导肝癌细胞凋亡。总之，紫草萘醌类衍生物对肝癌治疗提供了试验数据和理论依据。
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