吴星星 洪海波 甘志承 李瑞宁 黄先忠
（安徽科技学院农学院 作物生物技术研究中心，滁州 233100）
在真核生物中，MCM1‑AGAMOUS‑DEFICIENS‑SRF（MADS‑box）是植物生理和发育过程中的一类转录因子［1］，具有保守性很强的DNA 结合结构域［2］。MADS‑box 不仅在植物生殖发育各个方面起着关键性调控，而且在控制开花时间、花序结构、花器官身份确定和种子发育中具有重要作用［3］。开花是建立作物产量的一个脆弱但关键的阶段，适时适机开花不仅影响株型结构，对获得最佳产量至关重要，开花生物学机制研究一直是重要的研究课题。
MADS‑box 包 括I 型 和II 型 两 种 类 型，II 型MADS‑box 主 要 参 与 花 器 官 发 育［4］。PISTILLATA（PI）既属于典型Type II 型MADS‑box 基因亚家族中的一类，也是ABC（D）E 模型中的B 类基因［5］。Coen 等［6］最早提出花发育ABC 模型，后来又发展出ABCDE 模型［2］，其中，A 类基因是形成萼片所必需的，A+B+E 类基因决定花瓣的发育，B+C+E类基因决定雄蕊的发育，C+E 类基因决定心皮的形成，D 类基因与胚珠发育有密切联系，而E 类基因在所有过程中都起作用［7-9］。在模式植物拟南芥中，APETALA1（AP1）是典型的A 类基因；
而属于B类基因的是AP3 和PI；
AGAMOUS（AG）是一种具有C 类功能的代表性基因；
SEPALATA（SEP）则属于E 类基因；
D 类基因包括SEEDSTICK（STK）和SHATTERPROOF1（SHP1）［10］。PI 是调控植物花器官发育的B 类基因，是花瓣和雄蕊形成的关键因子。高表达的拟南芥PI，通过控制AP1 的表达来控制花的发育［11-12］。不同植物中，PI 功能并不完全保守，而是具有一定差异［13］。在漫长的演化过程中，植物PI 同源基因在经历了多次基因复增事件后，产生了许多亚功能化或者新功能化的基因，对于调控植物花器官多样性具有重大意义［14］。
辣椒（Capsicum annuum L.）为茄科（Solanaceae）辣椒属（Capsicum）一年或有限多年生草本植物，为重要的经济和香料作物，在我国南北均有大量传播和种植［15］。由于辣椒独特的风味和辣椒素，使辣椒在全世界食品和医药上不可缺少［16］。辣椒是雌雄同株自花授粉植物，其产量性状与辣椒开花时间和开花数量息息相关［17］。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）［18］、人参（Panax ginsengy）［19］、萼脊兰（Sedirea japonica）［20］、 大 蒜（Allium sativum）［21］、墨 兰（Cymbidium sinense）［22］、 牡 丹（Paeonia suffruticosa）［23］等植物中的PI 克隆和功能分析都有报道，但关于辣椒PI 同源基因的序列、表达特征和功能未见报道。Gan 等［24］对辣椒MADS‑box 基因家族的全基因组鉴定、进化及表达特征进行了分析，鉴定了一个辣椒PI 同源基因，但未见功能报道。
本研究利用RT‑PCR 技术从一年生辣椒中克隆CaPI；
利用生物信息学的方法分析序列特征，分析辣椒CaPI 蛋白理化性质和预测蛋白二级三级结构；
利用实时荧光定量PCR（RT‑qPCR）分析CaPI 基因在不同组织和不同花器官组织的表达特征；
通过构建35S:CaPI 过表达载体对拟南芥进行遗传转化，对转基因拟南芥进行表型分析，从而初步探索CaPI 基因功能。本研究为将来深入探索辣椒PI‑like 同源基因的功能及其分子机制奠定基础。
1.1 材料
材料为一年生辣椒（Capsicum annuum）自交系（编号G7），由安徽科技学院辣椒遗传育种团队提供，无限生长型、花单生、花期适中。将辣椒播种在育苗盘中育苗，然后移栽至温室（白天25℃ 16 h/黑夜18℃ 8 h，湿度60%）。采集生长6 周龄植株的根、茎、叶组织和生长3 个月盛开的花器官组织，包括雌雄蕊、花瓣、花萼及长度3 cm 的果实，液氮速冻后，‑80℃保存，3 次生物学重复。
1.2 方法
1.2.1 系统进化树构建 从TAIR（https://www.arabidopsis.org/）下载拟南芥AtPI（AT5G20240）蛋白序列，与已鉴定的辣椒MADS‑box 基因家族进行BLAST 比对［24］，鉴定出CaPI‑like 基因（CaMADS61,Caz06g18830.1）。从辣椒数据库（http://ted.bti.cornell.edu/cgi‑bin/pepper/index）下 载CaPI 蛋 白 序 列。从Ensembl Plants（http://plants.ensembl.org/index.html）下 载 茄 子（Solanum melongena）、 番 茄（Solanum lycopersicum）、马铃薯（Solanum tuberosum）、矮牵牛（Calibrachoa）、水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）等植物的PI‑like 蛋白序列。利用MEAG 11 软件中的Clustal W［25］功能进行同源蛋白多重序列比对，利用MEGA 11 的Neighbor‑joining 功能构建系统进化树，参数均为默认［26］。
1.2.2 CaPI 蛋白理化性质分析 使用ProtParam 在线网站（https://web.expasy.org/protparam/）分析CaPI蛋白质的理化性质，用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）在线网站进行蛋白质的疏水性行分析；
利用NetPhos（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos）对PI 蛋白进行磷酸化位点预测；
利用SOPMA（https://npsa‑prabi.ibcp.fr/cgi‑bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html）对蛋白二级结构进行预测；
使用Phyre2 在线网站（http://psort.hgc.jp/）分析蛋白质的三级结构。
1.2.3 辣椒总RNA 提取和cDNA 第一链的合成 使用TRIzol（Invitrogen, 美国）试剂，参照牛西强等［27］方法提取辣椒不同组织的总RNA。经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量，利用Nano Drop 2000 超微量分光光度计检测RNA 浓度与质量。使用MonScriptTMRTIII AII‑in‑One Mix with dsDNase（Monad，武汉）试剂盒合成cDNA 第一链。
1.2.4 RT‑qPCR 根据辣椒CaPI 编码区（CDS）序列设计RT‑qPCR 引物（表1），以CaUBI3 作为内参基因［28］，反应体系为5 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，南京）、0.5 μL 上下游引物、1 μL cDNA，ddH2O 补至10 μL。反应程序为95℃ 30 s；
95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 个循环，溶解曲线95℃ 15 s；
60℃ 60 s，95℃ 15 s，设置3个生物学重复。采用2-ΔCT计算［29］基因的相对表达量。利用Excel 2019 软件计算基因相对表达水平，使用Graph Pad Prism 8.0 软件作图和进行统计学分析。
表1 本研究使用到的引物Table 1 Primer information used in this study
1.2.5 CaPI 的克隆及过表达载体的构建 采用RT‑PCR 的方法克隆CaPI 的开放阅读框序列，反应体系为10 μL 2×Phanta Max Master Mix、0.5 μL 上下游引物、2 μL 花组织cDNA，ddH2O 补至20 μL。反应程序为95℃ 3 min；
95℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 15 s，35 个循环；
72℃ 10 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段，与pEASY 载体连接，转化大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养。提取阳性克隆的质粒，酶切鉴定，送南京通用生物有限公司滁州分公司测序。
测序正确的pEASY‑CaPI 质粒，经Kpn I 和Xba I限制性内切酶酶切后，与pCAMBIA2300‑35S 载体连接，构建35S:CaPI 植物过量表达载体，转化至农杆菌GV3101 感受态，用于拟南芥遗传转化。
1.2.6 拟南芥的遗传转化及表型分析 将野生型拟南芥（Col‑0）种子用75%乙醇表面消毒10 min，无水乙醇清洗3 min。均匀撒播在1/2 MS 培养基中，4℃黑暗处理3 d，转至22℃光照培养箱（16 h 光照/8 h 黑暗）培养。生长7 d 后，将拟南芥幼苗移栽到含有蛭石∶营养土（体积比1∶1）的盆钵中，长日照（16 h 光照/8 h 黑暗）光照培养间培养，待生长至开花前期，采用floral‑dipping［30］方法将含有35S:CaPI农杆菌GV3101 菌液侵染到Col‑0 花苞上，在整个花期重复3 次侵染，待植株成熟后收获T0拟南芥种子。经卡那霉素和PCR 筛选，获得35S:CaPI 转基因拟南芥植株，经多代繁殖后，获得纯合转基因植株。待植株开花时，统计不同时期的野生型拟南芥和转基因拟南芥植株的莲座叶数、分枝数和开花天数，使用Graph Pad Prism 8.0 软件作图并进行统计学分析。收集开花时野生型和转基因拟南芥植株的莲座叶，提取RNA 并反转录成cDNA，利用RT‑qPCR 分析该基因在植株中的表达量。
2.1 CaPI蛋白的理化性质
CaPI 蛋白的分子式为C1075H1755N329O333S16，由215 个氨基酸组成，分子质量为25.13 kD，等电点为8.74，脂肪系数为74.42，不稳定蛋白系数为61.02。CaPI 蛋白亲水性指数为‑0.894，预测为亲水蛋白。在线预测结果表明，CaPI 蛋白没有跨膜结构，亚细胞定位在细胞核。一级结构表明谷氨酸（Glu 10.7%）、赖氨酸（Lys 8.4%）、亮氨酸（Leu, 7.9%）、精氨酸（Arg 7.9%）、丝氨酸（Ser 7.0%）的含量较多，而色氨酸（Trp 0.5%）、苯丙氨酸（Phe 0.9%）、半胱氨酸（Cys 0.9%）含量较少。带正电荷的氨基酸（Arg+Lys）有35 个，带负电荷的氨基酸（Asp+Glu）有32 个。磷酸化分析结果（图1）显示，该氨基酸序列中Ser 位点可能有15 个被磷酸化，Thr 位点5个被磷酸化，Tyr 位点7 个被磷酸化。
图1 辣椒CaPI 蛋白磷酸化位点分析Fig.1 Analysis of phosphorylation sites of CaPI protein in C.annuum L.
2.2 CaPI蛋白的二级结构和三级结构分析
通过SOPMA 预测CaPI 二级结构，主要由α 螺旋组成（图2‑A），有128 个α-螺旋（59.53%）、26个延伸链（12.09%）、48 个无规则卷曲（22.33%）及13 个β-转角（6.05%）。进一步使用Phyre2 预测CaPI 三级结构（图2‑B），表明具有丰富的α 螺旋，与二级结构预测结果一致。此外，辣椒CaPI 与拟南芥AtPI 蛋白三级结构比较，都具有相同的α 螺旋。
图2 CaPI 蛋白结构分析Fig.2 Structural analysis of CaPI protein
2.3 不同物种PI基因系统进化树分析
为了研究辣椒CaPI 基因与其他植物中PI 基因的进化关系，进一步利用辣椒、茄子、番茄、马铃薯、矮牵牛、拟南芥、水稻、小麦中的17 个PI‑like 蛋白的氨基酸序列进行比对和系统进化树分析。结果（图3）发现，所有蛋白质都具有N 端“MGRGKIEIKRIEN”的氨基酸保守基序，说明PI 蛋白在其他物种中都具有较高的保守性［31］。系统进化树分析表明（图4），同为茄科作物的马铃薯（PGSC0003DMG401007392）、番茄（Solyc06g0557.4.1）和矮牵牛（Peaxi162Scf00 91g00074.1）的PI 蛋白与CaPI 蛋白相似性较高；
与水稻和小麦的PI 蛋白进化关系较远。
图3 植物PI 类蛋白氨基酸序列多重序列比对Fig.3 Multiple amino-acid sequence alignments of the plant PI-like proteins
图4 辣椒CaPI 蛋白和其他植物的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of the CaPI proteins in C.annuum L.and other plant species
2.4 CaPI在辣椒不同组织中的表达分析
运用RT‑qPCR 分析CaPI 在根、茎、叶、花、果实，以及花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊中的表达情况。CaPI在辣椒花中高表达，但在其他组织中均不表达（图5‑A）；
CaPI 在花萼中表达量最高，其次是花瓣，在雄蕊中有较高的表达，但在雌蕊中几乎不表达（图5‑B）。暗示CaPI 在辣椒花器官的发育中起着重要的功能。
图5 RT-qPCR 分析CaPI 的组织表达特征Fig.5 Tissue expression pattern of the CaPI gene using RT-qPCR
2.5 拟南芥中过量表达CaPI的功能分析
为了探索CaPI 的功能，克隆CaPI 的648 bp 的ORF，测序证实基因ORF 长648 bp，编码215 个氨基酸。进一步构建植物过量表达载体35S:CaPI，利用浸花法转化到拟南芥Col‑0 中，经基因组扩增及RT‑qPCR 鉴定证实获得纯合的转基因植株。
当野生型和转基因植株开花时进行莲座叶数、开花天数、分枝数等表型统计（图6‑A）。结果发现，长日照条件下，35S:CaPI 转基因植株同Col‑0 的莲座叶数目（图6‑B）和开花时间（图6‑C）没有差异，表明过量表达CaPI 不影响开花时间。但35S:CaPI转基因植株的分枝数量明显均多于Col‑0，并且#2中的分枝数量明显多于#1（图6‑A, D）。RT‑qPCR分析也证实CaPI 在转基因株系#1 和#2 中高表达，并且在#2 中的表达量明显高于#1（图6‑E），表明分枝数量与表达量正相关，说明该基因在分枝发育过程中起十分重要的作用。此外，花的形态比较（图7）发现，与野生型（Col‑0）对照相比，35S:CaPI转基因拟南芥植株并未发生变化，说明CaPI 在拟南芥中过量表达不影响其花部组织的形态结构。
图6 35S:CaPI 转基因拟南芥的表型分析Fig.6 Phenotype survey of the 35S:CaPI transgenic plants in Arabidopsis thaliana
图7 拟南芥野生型（Col-0）与35S:CaPI 转基因植株花形态对比Fig.7 Comparison of flower morphologies between the wild-type（Col-0）and 35S:CaPI transgenic Arabidopsis plants
MADS‑box 作为植物最大转录因子家族之一，名称来自酿酒酵母转录因子MCM1、拟南芥花同源异型基因AGAMOUS、金鱼草花同源异型基因DEFICIENS 和人血清应答因子SRF 这4 种蛋白的首字母［2,30］。目前，43%-81%驯化基因由转录因子编码［3］，MADS‑box 是调控植物生长发育最重要的转录因子之一，从种子发芽、营养发育到花器官发育阶段都起着重要作用［32］。PI 基因作为II 型MADS‑box 家族中的一员，与A 类和C 类基因共同调控花瓣和雄蕊的形成，其中，包括GLOBOSA（GLO）、DEFICIENS（DEF）、AP3 等花发育调控基因，并在拟南芥中证明PI 与AP3 基因相互正调控［33］。最早在水稻中鉴定出两类PI 基因OsMADS2 和OsMADS4，其中OsMADS2 表达随着花的成熟而快速增加，而OsMADS4 的表达从花发育早期就处于较高的水平［34-35］。
玉 米 中 已 鉴 定 出Zmm16、Zmm18 和Zmm29，其中Zmm16 在营养器官中微弱表达［36］。
本研究从一年生辣椒花器官中克隆PI 全长cDNA 序列，命名为CaPI。CaPI 有完整的开放阅读框，编码215 个氨基酸。CaPI 蛋白与多种植物类PI 蛋白序列有较高的相似度，其中，与矮牵牛相似度最高达99.54%。PI 基因所编码的蛋白质在不同物种中相对保守，都具有N 端“MGRGKIEIKRIEN”的氨基酸保守基序，因此，不同物种之间PI 同源基因具有相似的功能。系统进化树表明CaPI 与马铃薯分为一支，该分支与同为茄科植物形成的分支较为接近，与单子叶植物水稻分支最远，说明CaPI 与马铃薯PI 基因亲缘关系最近。通过对CaPI 理化性质和蛋白结构进行分析发现，CaPI 属于不稳定蛋白，并预测为亲水蛋白且没有跨膜结构；
一级结构和磷酸化分析表明，CaPI 蛋白可能被丝氨酸蛋白激酶、苏氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶进行磷酸化修饰而被激活，从而调控二级响应基因的表达；
二级结构分析发现，CaPI 主要以α-螺旋为主，这与其他MADS‑box 基因相同［37］；
三级结构显示CaPI 属于异质二聚体蛋白，暗示其与其他蛋白互作形成二聚体发挥功能，这一点在拟南芥中已有研究［38］。
CaPI 在辣椒不同组织表达特征存在差异，PI 同源基因在芸薹属油菜（Brassica napus）早期和晚期花蕾中表达差异明显［39］；
在甜瓜中，PI 基因通过调节下游靶基因的转录调控花性别发育，促进雄蕊的发育［40］。本研究中，CaPI 主要在花组织中特异表达，其中在花萼、花瓣、雄蕊中表达量最高，暗示CaPI在花器官的形成中起着十分重要的作用。为了研究CaPI 的功能，通过构建35S:CaPI 过表达载体，在野生型拟南芥（Col‑0）中异源表达验证其功能。结果显示，长日照条件下转基因植株同Col‑0 相比表现出分枝数增多，但莲座叶数目和开花时间与Col‑0 相比并没有明显差异，说明CaPI 过量表达不影响开花时间；
进一步分子水平检测发现，转基因植株CaPI的表达量相比Col‑0 显著上调，并且在#2 中的表达量明显高于#1，暗示分枝数量与表达量正相关，说明CaPI 在分枝发育过程中起重要作用。对于这一结果推测是由于CaPI 的异源表达，使拟南芥某些分枝发育相关基因的表达发生变化，从而影响了分枝发育的调控网络。有研究表明PI 基因不仅在花中发挥作用，也有可能在枝条和叶片发育中发挥作用［41］，但在辣椒中CaPI 调控分枝发育使分枝增多的分子机制、CaPI 转录因子的靶蛋白目前还未知。
总之，本研究从蛋白结构、氨基酸序列和系统进化分析，都表明CaPI 蛋白与其他物种中的蛋白序列较为相似。基因组织表达，证明CaPI 符合II 型MADS‑box 基因的表达情况。拟南芥中过量表达的结果表明CaPI 具有促进分枝的功能。综上所述，本研究为进一步深入研究CaPI 调控辣椒分枝发育的功能及其分子机制奠定了基础，为辣椒的分子育种提供基因元件，丰富茄科植物PI 类基因功能机制。
从一年生辣椒中克隆获得CaPI 基因，ORF 长648 bp，编码215 个氨基酸。CaPI 在花中的表达量最高，其中，在花萼、花瓣和雄蕊中有高表达。过量表达CaPI 拟南芥侧枝增多，CaPI 能够促进分枝发育。
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