杨 凡, 邵轶群, 贾默然, 聂伟东, 王田田, 彭 煜
(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,上海 200080)
膀胱癌(bladder cancer, BC)是世界上最常见的一种泌尿生殖系统恶性肿瘤[1]。目前,BC的治疗包括根治性膀胱切除术、放疗和化疗。然而,约有5%的患者在诊断时有远处转移。晚期或转移性BC的治愈效果差、预后差,接受一线铂类化疗的患者1年总生存率仅为36%[2]。因此,迫切需要有效抑制BC而又有较低毒副作用的药物。
重楼皂苷Ⅶ(paris saponin Ⅶ, PSII)是一种从传统中草药延龄草中分离出来的甾体皂苷,已经成为了一种潜在的抗癌剂。PSII通过抑制小鼠肺腺癌的基质金属酶来抑制肺癌转移,激活caspase-2和线粒体的功能障碍诱导HT-29细胞的凋亡[3-4]。然而,目前PSII对BC发生的影响及其内在机制仍不清楚。在这项研究中,我们的目的为探究PSII在体外对BC细胞的潜在细胞毒性作用及其作用机制,以期为BC的治疗和新药开发提供理论依据。
T24和5637细胞株购于上海中科院细胞库。PSII购于四川省维克奇;N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine, NAC)、 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)购于MedChemExpress;细胞凋亡检测试剂盒,DCFH-DA荧光探针购于上海翌圣;Bax、Bcl-2、LCB-II、Beclin 和P62一抗购买于Cell signing technology;MitoSOXTM线粒体超氧化物指示剂购买于赛默飞。
2.1 细胞培养T24和5637细胞培养于用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素),细胞培养于37 ℃,5% CO2培养箱。
2.2 CCK-8法检测细胞活力 PSII处理24 h后使用CCK-8检测细胞活力。
2.3 克隆形成实验细胞接种于12孔板,过夜贴壁后,加入PSII进行干预;培养12 d后,用4%多聚甲醛固定,随后加入结晶紫溶液染色,拍照。
2.4 流式细胞检测细胞凋亡PSII处理24 h后,加入Annexin V和PI染液,孵育15 min后,上流式细胞仪检测。
2.5 GFP-mRFP-LC3B稳转细胞株构建按照说明书转染构建GFP-mRFP-LC3B稳转细胞株。加入PSII后,使用共聚焦进行拍照。
2.6 Western blot检测使用RIPA裂解细胞,BCA试剂盒测定总蛋白的浓度。使用SDS-PAGE凝胶电泳方法分离蛋白,转移至PVDF膜上,使用5% BCA封闭1 h,4 ℃孵育一抗过夜。
2.7 流式细胞检测细胞ROS和线粒体ROS不同浓度PSII孵育24 h。收集细胞,加入DCFH-DA或MitoSox Red (5 μmol·L-1),37 ℃孵育30 min,流式细胞仪检测。
2.8 ROS抑制剂NAC干预实验预给药PSII 2 h,随后NAC干预22 h。实验结束后每孔加入CCK-8检测细胞活力。
3.1 PSII增强BC细胞毒PSII处理后,显著降低细胞存活率,并且具有浓度依赖性。IC50值分别为7.76、9.88 μmol·L-1。同时,与对照组相比,PSII明显降低细胞克隆形成能力。
3.2 PSII诱导BC细胞凋亡与空白组相比,PSII组细胞凋亡增加。Western blot结果显示, PSII组细胞Bax与Bcl-2的比值明显减少(P<0.05)。
3.3 PSII增强T24细胞中自噬流PSII处理后细胞显示明显的荧光信号,诱导细胞发生自噬。
3.4 PSII刺激BC细胞自噬相关蛋白表达水平PSII处理后,显著增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表达,降低p62蛋白表达(P<0.05)。
3.5 PSII诱导T24细胞中及线粒体ROS产生PSII促进T24细胞及线粒体产生ROS,且具有显著性差异(P<0.05)。
3.6 清除ROS减轻PSII诱导的T24细胞凋亡和自噬NAC干预后,PSII的促细胞凋亡效果被减弱。与PSII组比较,PSII+NAC组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表达明显降低(P<0.05),P62蛋白表达明显增加(P<0.05)。
过度的自噬被认为是一种潜在的肿瘤抑制途径,能够诱导癌细胞的程序性死亡[5]。在自噬体的形成过程中,LC3-Ⅰ被修饰并转化为LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比例与自噬程度有关。Beclin1调控自噬体的形成和成熟。同时,P62蛋白在自噬体的形成过程中被降解,P62蛋白的表达与自噬活性呈负相关关系。腺病毒感染的目标细胞可以有效地表达红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)和LC3B蛋白的融合蛋白[6]。通过观察GFP-mRFP-LC3B融合蛋白的颜色,显示细胞的自噬流。有证据表明,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的过度产生会诱导氧化应激启动凋亡途径,从而导致BC细胞的死亡[7]。因此,ROS水平可能是大量导致癌细胞凋亡的抗肿瘤化合物的关键指标。
综上所述,PSII能够显著抑制BC细胞的增殖,诱导其凋亡和自噬,其机制与ROS密切相关。该研究扩展了对PSII在抗肿瘤方面的研究,为进一步研究和开发PSII提供了参考。
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