郝玉娟 周 辉 曹 蒙
卵巢癌是女性生殖道恶性肿瘤中发病率第三,病死率第一的妇科恶性肿瘤,其中上皮性卵巢癌居多,5年生存率低于45%。卵巢癌大多发生在50岁以上的人群中,患者常出现非特异性盆腔或腹部症状[1-2]。初步诊断检查包括经阴道超声检查和血清肿瘤抗原125测定。然而,这些检测并不针对卵巢癌。常规治疗包括手术减积,然后化疗[3-4]。预后通常由癌症的分期和分级决定,尽管未来的治疗可能取决于肿瘤的基因组成。然而在上皮性卵巢癌发生后,由于70%的病例在Ⅲ期或Ⅳ期被诊断,因此预后较差[5-6]。卵巢癌多发生在围绝经期并且进展速度较快,该过程与激素引起免疫紊乱和血管丰富程度密切相关[7]。据报道,卵巢癌组织中血管生成与血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)高表达存在紧密联系,VEGF结合受体后能够促进卵巢癌新生血管生成并加快肿瘤发展[8]。据报道,抗肿瘤药物贝伐珠单抗能够抑制血管内皮生长因子的活性,进而抑制血管形成和肿瘤发展。研究表明,贝伐珠单抗联合化疗方案有利于提高贝伐珠单抗在卵巢癌等癌症方面的治疗效果[9]。目前,相关研究发现NF-κB/HIF-1α/VEGF通路在肿瘤发展中发挥促进作用,例如调控该信号通路能够干扰食管癌、乳腺癌和皮肤鳞状细胞癌的发展[10-12]。然而,关于贝伐珠单抗联合化疗治疗方案与NF-κB/HIF-1α/VEGF通路在卵巢癌中的关系以及该通路对卵巢癌的发展尚未有过系统性报道。因此,本研究旨在探讨贝伐珠单抗在其联合化疗药物后对卵巢癌的抑癌效果及其相关机制,以期发现新的抗卵巢癌方法。
1.1 主要材料
人卵巢癌SKOV3细胞(广州博辉生物科技);紫杉醇(美国sigma公司);贝伐珠单抗(美国sigma公司);青霉素/链霉素(美国Invitrogen公司);RPMI 1640(安诺伦生物科技有限公司);VEFG抗体(英国abcam公司,ab32152);NF-κB p65抗体(美国CST公司,8242S);HIF-1α抗体(美国CST公司,36169S);GAPDH抗体(英国abcam公司,ab8245);Ki-67抗体(美国Santa Cruz公司,SC-23900);Bax抗体(英国abcam公司,ab32503);Bcl-2抗体(英国abcam公司,ab141523)。
1.2 细胞培养与分组
细胞在RPMI 1640培养基(10%胎牛血清)中培养,培养环境为37 ℃和5%浓度的二氧化碳。将细胞分为三组,分别为:①对照组;②贝伐珠单抗组;③联合用药组。其中贝伐珠单抗组的给药浓度为5 μM,联合用药组的给药浓度为贝伐珠单抗(5 μm)和紫杉醇(1 μm),药物处理24 h后开展后续实验。
1.3 MTT实验检测细胞增殖能力
将SKOV3细胞接种在96孔板中,按照不同实验组进行不同处理,各组细胞孵育24 h后按照试剂说明书使用MTT试剂进行染色,反应4 h后洗涤未结合的染料,并将染色的细胞溶解在150 μL DMSO中,在490 nm处检测吸光度以反映细胞增殖能力。
1.4 流式细胞术分析SKOV3细胞凋亡率
不同实验组处理24 h后,PBS轻微冲洗2次后,在4 ℃下用70%乙醇固定1 h。细胞与50 μL RNase在室温下孵育10 min以降解RNA。将细胞在4 ℃下以1 500 g离心5 min,然后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶在室温下暗处双染色30 min。使用流式细胞术分析SKOV3细胞凋亡率。
1.5 细胞集落形成实验分析细胞生长能力
将各组SKOV3细胞用0.25%胰蛋白酶从培养皿消化后,并以3×105个细胞/孔的数量转移到6孔板培养皿中,24 h后将50个细胞接种于6孔培养皿中,继续培养2个星期,将细胞用结晶紫溶液染色20 min并在显微镜下计数。
1.6 Western blotting检测蛋白表达变化
使用RIPA裂解缓冲液从细胞系中提取总蛋白质样品,并使用考马斯亮蓝测定蛋白质浓度。将变性后蛋白样品在12% SDS-PAGE胶上开始电泳分离,电泳完成后将DS-PAGE胶转移到PVDF膜上。用在5%脱脂牛奶室温封闭膜2 h。然后,将PVDF膜与对应的一级抗体在4 ℃下孵育过夜。用TBST洗涤后,将PVDF膜与二级抗体在室温下孵育2 h,并通过增强型化学发光检测系统捕获印记信号。
1.7 Trans well实验分析SKOV3细胞迁移能力
在无血清RPMI-1640培养基下,将给药处理完成后的SKOV3细胞转移到Transwell小室的上面。将含有15%血清的RPMI-1640培养基加入下室。24 h后,在显微镜下观察到侵入下室的细胞,随后用结晶紫染色,使用Image J软件统计SKOV3细胞侵袭情况。
1.8 裸鼠异种移植肿瘤模型建立
30只雌性BALBc-Nude裸鼠购于集萃药康公司,并将裸鼠置于SPF级动物实验室的环境中饲养,自由饮食、饮水。将SKOV3细胞(1×106个细胞)悬浮在100 μl无血清培养基中,并皮下注射到4～6周龄的裸鼠腋下,饲养2周;当肿瘤体积达到30 mm3时,将接种肿瘤细胞的裸鼠按随机分为3组,每组10只。对照组裸鼠腹腔注射PBS,1次/天;贝伐珠单抗组腹腔注射贝伐珠单抗(1.5 mg/kg,溶于PBS),1次/天,联合用药组腹腔注射贝伐珠单抗(1.5 mg/kg,溶于PBS)+紫杉醇(0.5 mg/kg,溶于PBS)1次/天。各组每日采用游标卡尺测量肿瘤大小,然后通过统计每组裸鼠肿瘤体积。在干预第5个星期后,安乐死裸鼠,分离出肿瘤,称重后以10%甲醛溶液固定。
1.9 裸鼠肿瘤组织Ki-67表达检测
采用免疫组织化学法。各组裸鼠肿瘤组织固定48 h后使用石蜡包埋,将包埋后的组织进行切片,然后脱蜡复水,进过抗原修复、过氧化氢酶处理,封闭等步骤后,将切片与Ki-67抗体一起孵育,在含5%BSA的PBS中4 ℃孵育过夜。次日与辣根过氧化物酶偶联物孵育切片,DAB显色。最后使用显微镜观察,使用图像分析软件Olympus cell Dimension计算阳性率。
1.10 统计学分析
应用SPSS 24.0软件进行统计分析。所有数据均以mean SD表示。两组或多组比较采用t检验或单因素方差分析。P<0.05为差异具有显著性。
2.1 贝伐珠单抗联合化疗药物对SKOV3细胞中NF-κB/HIF-1α/VEGF通路的影响
与对照组相比,贝伐珠单抗组、联合用药组SKOV3细胞中VEGF/HIF-1α/NF-κB蛋白的表达水平下降(P<0.05)。与贝伐珠单抗组相比,联合用药组SKOV3细胞中VEGF/HIF-1α/NF-κB蛋白的表达水平明显下降(P<0.05),见图1,表1。结果提示,贝伐珠单抗联合化疗药物对SKOV3细胞中VEGF/HIF-1α/NF-κB通路具有抑制作用。
表1 SKOV3细胞中NF-κB/HIF-1α/VEGF通路的相对表达水平
注:A为Western blotting分析结果;B为Western blotting实验结果。
2.2 贝伐珠单抗联合化疗药物对SKOV3细胞增殖和侵袭的影响
与对照组相比,贝伐珠单抗组、联合用药组SKOV3细胞增殖能力、侵袭能力均下降(P<0.05)。与贝伐珠单抗组相比,联合用药组SKOV3细胞增殖、侵袭能力明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05),见图2和表2。结果提示,贝伐珠单抗联合化疗药物对SKOV3细胞的增殖、侵袭能力具有抑制作用。
表2 贝伐珠单抗联合化疗药物对SKOV3细胞增殖、侵袭的影响
注:A为SKOV3细胞集落形成实验结果;B为细胞侵袭实验结果(400×);C为细胞集落形成实验结果的统计分析;D为细胞侵袭实验结果的统计分析;E为MTT实验结果的统计分析。
2.3 贝伐珠单抗联合化疗药物对SKOV3细胞凋亡的影响
与对照组相比,贝伐珠单抗组、联合用药组SKOV3细胞凋亡率增高(P<0.05)。与贝伐珠单抗组相比,联合用药组SKOV3细胞凋亡率明显增高(P<0.05),见表3和图3。结果提示,贝伐珠单抗联合化疗药物能够促进SKOV3细胞凋亡。
表3 贝伐珠单抗联合化疗药物对SKOV3细胞凋亡的影响
注:①②③为流式细胞术检测SKOV3细胞凋亡结果图像;④为细胞凋亡率的统计分析。
2.4 贝伐珠单抗联合化疗药物对裸鼠移植肿瘤NF-κB/HIF-1α/VEGF通路的影响
往BALBc-Nude裸鼠体内植入SKOV3细胞5周后,与对照组相比,贝伐珠单抗组、联合用药组裸鼠移植肿瘤中VEGF/HIF-1α/NF-κB蛋白的表达水平下降(P<0.05)。与贝伐珠单抗组相比,联合用药组裸鼠移植肿瘤中VEGF/HIF-1α/NF-κB蛋白的表达水平明显下降(P<0.05),见表4和图4。结果提示,贝伐珠单抗联合化疗药物对裸鼠移植肿瘤VEGF/HIF-1α/NF-κB通路具有抑制作用。
表4 肿瘤组织中NF-κB/HIF-1α/VEGF通路的相对表达水平
注:A为Western blotting分析NF-κB/HIF-1α/VEGF通路蛋白表达的结果;B为Western blotting实验结果的统计分析。
2.5 贝伐珠单抗联合化疗药物对裸鼠移植肿瘤的影响
往BALBc-Nude裸鼠体内植入SKOV3细胞5周后,与对照组比较,贝伐珠单抗组、联合用药组裸鼠移植肿瘤体积均缩小,差异均有统计学意义(P<0.05)。与贝伐珠单抗组相比,联合用药组裸鼠移植肿瘤体积明显缩小(P<0.05)。此外,免疫组化结果显示,与对照组比较,贝伐珠单抗组、联合用药组裸鼠移植肿瘤中Ki-67表达降低,凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的比值升高(P<0.05),与贝伐珠单抗组相比,联合用药组裸鼠移植肿瘤中Ki-67表达明显降低,凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的比值升高(P<0.05),见图5。结果提示,贝伐珠单抗联合化疗药物能够抑制裸鼠移植肿瘤的生长。
注:A为三组肿瘤生长曲线比较;B为三组肿瘤体积比较;C为Ki-67在各组织中的表达;D为Western blotting分析Bax和Bcl-2蛋白表达。
上皮性卵巢癌是最常见的卵巢癌类型,由于70%的病例在Ⅲ期或Ⅳ期被诊断,因此预后较差,开发新的治疗技术手段有利于提高卵巢癌患者总生存期[1]。卵巢癌的发病率和死亡率很高,部分原因是患者往往被诊断为晚期,严重影响了他们的生活质量。值得庆幸的是,贝伐珠单抗已被发现可以与VEGF进行结合,阻断生物活性,减少肿瘤血管形成,抑制肿瘤生长[9]。
在本研究中,我们发现贝伐珠单抗以及联合化疗在体外和体内诱导卵巢癌细胞凋亡并降低细胞活力。另外,考虑到NF-κB/HIF-1α/VEGF通路在肿瘤发展中的促进作用,我们进一步研究了贝伐珠单抗以及联合化疗对卵巢癌细胞NF-κB、HIF-1α和VEGF表达的影响以及可能的分子机制,研究结果发现,贝伐珠单抗联合化疗抑制卵巢癌的作用可能与NF-κB/HIF-1α/VEGF通路相关。
HIF-1α作为癌细胞缺氧转录反应的主要调节因子,该因子上调一系列支持肿瘤细胞的基因,以补偿缺氧微环境[13]。有研究检测了37例接受光动力学疗法(PDT)治疗的早期食管癌中HIF-1α和HIF-2α的表达,他们发现HIF-1α的高表达与光动力学疗法(PDT)的作用呈负相关。此外,他们对食管癌细胞作用的研究表明,缺氧诱导的HIF-1α过度表达通过血管生成减弱了PDT的疗效[14]。VEGF是HIF-1α的下游靶基因,是最重要的血管生成蛋白之一。它与特定受体的结合可诱导静脉内皮细胞的增殖和迁移,改善血管通透性,最终促进血管生成[15]。另外,有研究在乳腺癌小鼠中发现贝伐珠单抗介导的PDT诱导异二聚体HIF-1转录因子的HIF-1α亚单位表达,并增加VEGF蛋白水平[16]。Ding等在裸鼠颅内胶质母细胞瘤异种移植物上使用了抗VEGF的单克隆抗体,发现该抗体可以显著增强PDT的作用[17]。所有这些研究表明,HIF-1α和VEGF的表达增加后可以诱导血管生成并减弱贝伐珠单抗疗效。
NF-κB是一种调节各种细胞过程的关键转录因子,包括胚胎发育、免疫、凋亡、血管生成和增殖。在活化之前,NF-κB蛋白主要通过与IκB家族成员结合而局限于胞浆[18]。IκB激酶对IκB-的磷酸化触发Iκ-B的降解,并允许NF-κB移位到细胞核[19]。既往研究发现,NF-κB过表达后增加了小鼠乳腺癌细胞的存活信号,并加剧了小鼠RAW 264.7巨噬细胞的炎症反应[20]。这些结果表明,抑制NF-κB可改善肿瘤发展恶化。肿瘤组织中NF-κB的表达与HIF-1α的表达、VEGF的表达以及血管侵犯的存在显著相关。NF-κB抑制剂,如BAY11-7028,也可以可以抑制HIF-1α和VEGF表达。此外,此外,姜黄素类似物在胰腺癌中的抗血管生成作用的研究表明,姜黄素类似品EF31和UBS109可以抑制NF-κB转录,在体内诱导HIF-1α和VEGF的下调。然而,HIF-1α沉默后,细胞的NF-κB p65没有变化。因此,我们猜想贝伐珠单抗以及联合化疗通过NF-κB/HIF-1α/VEGF信号通路抑制卵巢癌的发展。在本研究中,考虑到NF-κB/HIF-1α/VEGF通路在肿瘤发展中的促进作用,通过贝伐珠单抗以及联合化疗药物处理SKOV3细胞后,NF-κB p65蛋白表达被抑制,同时HIF-1α和VEGF的蛋白表达也受到抑制。另外,在裸鼠移植瘤的研究中发现,贝伐珠单抗以及联合化疗药物处理后,移植瘤的NF-κB p65蛋白表达被抑制,同时HIF-1α和VEGF的蛋白表达也受到抑制,这一研究结果证实了我们前面的猜想,贝伐珠单抗联合化疗抑制卵巢癌的作用可能与NF-κB/HIF-1α/VEGF通路相关。
综上所述,本研究发现,贝伐珠单抗联合化疗方案能够抑制卵巢癌的体内外发展,该作用可能与抑制NF-κB/HIF-1α/VEGF信号通路相关。
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