戈胜强，沙 洲，郑 辉，刘春菊，左媛媛，胡永新，王晓华，刘 爽，魏 荣，王志亮
（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；
2. 青岛市现代生物工程及动物疫病研究重点实验室，山东青岛 266032；
3. 农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室（南方），山东青岛 266032）
2018 年非洲猪瘟（African swine fever，ASF）传入我国后，在国内持续流行蔓延，目前疫情数量虽然大幅下降，但其病原已在我国定殖并形成较大污染面，疫情发生风险依然较高。我国最早传入的非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）为China 2018/1 株[1]（后重新命名为China/LN/2018/1[2]），是基因II 型毒株。随后相关研究机构在相近时间内分离到了pig/HLJ/18 株[3]和SY18 株[4]，其均为基因II 型毒株。这些分离株与2007 年传入格鲁吉亚的Georgia 2007 毒株[5]高度相似，致死率最高可达100%。2021 年国内报道发现基因I 型HeN/ZZ-P1/21 株和SD/DY-I/21 株，该类毒株仍具有一定毒力和水平传播能力，且组织脏器中病毒拷贝检测Ct 值达25 左右[6]。基因I 型和II 型毒株在同一区域内流行，过去只在非洲部分国家[7]和意大利撒丁岛[8]等区域发生。国外研究者曾报道过ASFV 重组毒株，但发生基因I 型和II 型重组的未见报道。2021 年以来，国内研究者在江苏省（Jiangsu/LG/2021 株，JS/LG/21）、河南省（Pig/Henan/123014/2022 株，HeN/123014/22）和内蒙古自治区（Pig/Inner Mongolia/DQDM/2022株，IM/DQDM/22）相继发现基因I 型/II 型重组毒株[9]，这是世界范围内首次报道此类相关重组毒株。目前，关于ASFV 重组毒株的国内外研究较少，尚缺乏系统的专业阐述，为此就相关研究进展进行总结归纳，以期为我国ASF 防控提供参考。
基因重组是许多病毒进化的重要驱动力[10]。基因重组事件通常发生在序列高度相似的病毒之间[11]，特别是DNA 病毒，如在ASFV、疱疹病毒（herpesviruses）、腺病毒（adenoviruses）、痘病毒（poxviruses）、双生病毒（geminiviruses）等病毒中均观察到重组现象[12-14]。值得注意的是，根据有限的基因组序列识别重组事件并非易事[15-16]。早期的ASFV 重组研究因缺乏足够完整的病毒基因组序列，只能对其进行相对简单的单基因重组分析。例如，16 株意大利分离株和1 株南非分离株的E183L基因（编码p54 蛋白）经RDP3 软件分析存在相似的重组事件，推测这些毒株来源于同一个重组毒株[17]。相似的，ASFV的多基因家族（MGF）以及B602L、EP153R和EP402R（编码CD2v 蛋白）等基因也存在重组事件[18]。例如，格鲁吉亚2007分离株（Georgia 2007/1）的EP402R基因与非洲马拉维分离株（Malawi Lil20/1）和肯尼亚分离株（Kenya 1950）相近，而其EP153R基因与疣猪分离株相近[19-20]。进一步的研究[21]显示，EP153R和EP402R基因的重组，促进了ASFV 血清型特异性位点进化，有利于病毒的进化生存。2019 年Peng等[22]对39 株ASFV 全基因组序列（包含多种基因型）分析发现，ASFV 基因组间存在广泛的同源重组，而同源重组是造成ASFV 遗传多样性的主要原因。2023 年Bao 等[23]进一步对41 株基因II 型ASFV 进行了遗传追溯研究，也证实了重组现象存在于基因II 型分离株中。
ASFV 发生重组必须满足以下条件：一是病毒基因组中存在大量重复序列并在病毒复制过程中发生基因替换等重组现象（此基因组特征已被广泛证实[24]）；
二是多株毒株共同感染（较高感染剂量）同一头猪，不同毒株间发生基因重组。临床中，双重感染（dual infections）、共同感染（co-infection）、重复感染（superinfections）在病毒感染宿主过程中并不罕见[25]。但实际上在ASF 流行历史中，流行毒株相对单一，因而发生双重感染的事件并不是很多。如莫桑比克在1960 年至1994 年间，存在同一疫情暴发期间两个基因型毒株共同传播，但并未发现共同感染的证据[26]。这其中的原因也可能是当时的鉴别诊断方法并不先进。如果某个地域存在多种毒株流行，就存在一定的双重感染发生概率。2017 年，Mulumba-Mfumu 等[27]在追溯研究中首次报道，在2005 年的同一份猪病料中分离到2 株基因I 型ASFV 毒株，在2010 年的疫情中分离到两个基因型毒株（基因I 型和基因XIV）。相似的，2021 年，Fiori 等[28]进行了ASFV 追溯性研究，从1984 年的野猪样品和2018 年的家猪样品中均发现了双重感染证据。鉴于检测双重感染的诊断技术具有一定难度，同时该研究在不到100 个样本中就发现有两种不同的双重感染，这有力说明了ASFV双重感染在意大利撒丁岛可能是相对常见事件，这可能与该地区ASFV 流行率高和多种毒株共同流行的现状紧密相关。
2021 年国内报道的基因I 型毒株（HeN/ZZP1/21 株和SD/DY-I/21 株）均无红细胞吸附活性（HAD-）[6]，这是国内基因I 型毒株最具代表的生物学特征之一。基因分型（I 型或II 型）由B646L基因（编码p72 蛋白）序列决定，红细胞吸附活性由EP402R基因（编码CD2v 蛋白）序列的完整性决定。因此，当研究者发现国内新分离基因I 型毒株具备红细胞吸附活性（HAD+）时，会首先联想到其B646L和EP402R基因发生了组合变化。基因I 型/II 型重组毒株（JS/LG/21、HeN/123014/22和IM/DQDM/22）可简单定义为，B646L基因来自于基因I 型，EP402R基因来自于基因II 型。但全基因组序列分析显示，该毒株的重组复杂程度远超之前国内外的其他所有重组分离株。根据基因I型和II 型ASFV 的特异性单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）分析，基因I 型/II 型重组毒株的全基因组序列可被拆分为20 个大的基因片段（F1—F20），其中10 个片段来源于基因I 型毒株（基因I 型相似率为99.36%～100%，基因II 型相似率低至71.28%～99.15%）， 另外10 个片段来源于基因II 型毒株（基因II 型相似率为99.95%～100%，基因I 型相似率低至27.50%～98.32%）。
基因I 型/II 型重组毒株毒力评价显示，该毒株的毒力与基因II 型强毒株（pig/HLJ/18）相当，某些致病指标甚至更高。如基因II 型强毒株（pig/HLJ/18）以106.5HAD50剂量攻毒后，最早在第6天出现感染猪死亡[3]；
而基因I 型/II 型重组毒株（JS/LG/21）以更低的106HAD50剂量攻毒后，最早在第5 天出现感染猪死亡。此外，该毒株可逃避基因II 型减毒活疫苗株（HLJ/18-7GD）[29]诱导的免疫保护，即对HLJ/18-7GD 免疫接种猪（肌肉注射，106TCID50）进行JS/LG/21 攻毒（肌肉注射，103TCID50），结果发现所有猪均在第10 天死亡。
之前也有类似ASFV 大片段重组的报道，重组区域最大为20 010 bp[30]，但像JS/LG/21 这样，仅以基因I 型和II 型基因序列为来源，不同长度片段（重组区域占比为1%～24%）交替重组的尚属首次发现，其基因组序列在某种意义上更近似基因I型/II 型嵌合基因组（mosaic genomes of genotype I and genotype II）的样貌。再加上基因II 型减毒活疫苗株不能对该毒株产生有效保护，结合ASFV 不同基因型间普遍存在交叉保护差的问题，这似乎也佐证了该毒株具备了基因I 型和II 型的双重特性，在生物学特性上具备了嵌合病毒的一些特征。该毒株在国内的流行演变可能会显著影响ASFV 的进化方向，并提示以基因II型为研究对象的疫苗半成品，将面临新的研制挑战。
过去研究认为，ASFV 在疣猪和软蜱中的长期持续感染可能为不同基因型毒株的共同感染及随后的基因重组提供了机会[31]。但由于鉴别诊断和全基因测序分析技术的滞后及流行毒株单一等，在东欧国家以及俄罗斯流行的基因II 型毒株（Georgia 2007 株来源）未出现重大的重组事件[21]。而我国分离的基因I 型/II 型重组毒株，因嵌合了两个基因型序列并部分整合了二者的生物学特性，使得我国流行分离株增加了新的分支。在原有基因II 型强毒株、基因I 型中等毒力毒株、基因II 型缺失株/变异株等共同流行的背景下，新出现的基因I型/II 型重组毒株可能会进一步“扰乱”现有毒株的进化方向，加速毒株向复杂化、差异化变异。但同时，基因I 型/II 型重组毒株，也会沿袭病毒演化规律[32]，经临床不断“驯化”后演变出毒力致弱的相关毒株，提示我国ASF防控形势将更加复杂。
此外，现有绝大多数核酸检测方法是针对B646L基因保守区，因此对于鉴定基因I 型/II 型重组毒株仍有效，但过分强调鉴别检测能力的新方法（特别是多重qPCR 方法），虽可对当前流行毒株进行鉴别检测，但伴随着毒株变异可能加速，变异方向不确定等因素，可能存在新研制检测方法很快失效的困境，需加以重视和区分。
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