廖小毓,方 辉,杨飞宇,邹多宏,2
引导性骨再生(guided bone regeneration,GBR)技术是口腔科常用的骨量提升技术之一,而 GBR 膜作为其关键材料之一,具有避免骨缺损部分被软组织侵占并引导新骨生长的重要作用[1]。然而,商用 GBR 膜如 Bio-Gide 膜等,存在机械性能不足、降解速度过快等问题,容易导致严重的并发症,如膜穿孔等[2]。因此,迫切需要开发一种高模量高强度的 GBR 膜。丝素蛋白是一种天然的蛋白质,主要存在于蚕丝的茧中。它具有良好的生物相容性,可在各种医学应用中使用,并不引起免疫反应。丝素蛋白可在体内逐渐降解并被代谢,为新生组织提供支撑,最终被身体自身的组织所替代[3]。丝素蛋白因其生物相容性、可降解性、机械性能、生物活性以及可塑性和可功能化的特点,使其在生物医药和组织工程领域具有重要的应用潜力。该研究以丝素蛋白作为原料,采用自蒸发方法使丝素蛋白溶液转变为膜材,并通过保湿、热压的方法进一步改变其蛋白质的二级结构,通过测试其湿态拉伸强度、蛋白质二级结构以及对细胞增殖黏附的影响等,探究其作为新型 GBR 膜的可行性。
1.1 主要试剂蚕茧(南浔练市久恒蚕丝制品经营部);蛋白酶 K、溴化锂(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);碳酸钠(上海国药集团化学试剂有限公司);小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)、小鼠成纤维细胞(L929)购自中国科学院细胞库;MWCO 3500 透析袋 (湖南翊博生物科技有限公司)。
MEM-α 培养基、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS)、杜氏磷酸盐缓冲溶液(Dulbecco’s phosphate buffered saline,DPBS)、胎牛血清、0.25%胰酶细胞消化液、青-链霉素(美国 Gibco 公司),CCK-8 试剂盒、Calcein-AM/PI 活/死细胞双染试剂盒(日本株式会社同仁化学研究所)。
1.2 主要仪器场发射扫描电子显微镜(JSM-IT800,日本电子株式会社),傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet iS50 FT-IR,美国 Thermo Fisher 公司),自动压片机(ZDZT-30T,天津市睿恒科技发展有限公司)、温控仪(ZTRM-1,天津市睿恒科技发展有限公司),酶标仪(Spark,美国 Biotek 仪器有限公司),倒置荧光显微镜(IX71,日本 Olympus 株式会社),细胞培养箱(IMH60-S,美国 Thermo Scientific 公司),冷冻离心机(MultifugeXPro Series,美国 Thermo Scientific 公司),万能力学试验机(5565A,美国 Instron 公司),冷冻干燥机(SCIENTZ-12N/A,宁波新芝士生物科技有限公司),激光扫描共聚焦显微镜(A1 RHD25,日本尼康株式会社)。
1.3 方法
1.3.1提取丝素蛋白溶液 将去蛹的桑蚕茧剪成片状,称取 4.24 g无水碳酸钠,溶于 2 L 去离子水,煮沸后加入 5 g蚕茧片,保持沸腾 30 min。取出蚕丝,去离子水洗冲洗、浸泡、拧干,重复 5 遍,直至彻底洗去丝胶和碳酸钠;洗净的蚕丝,放入 60 ℃ 烘箱过夜烘干,得到脱胶蚕丝。配制浓度为 9.3 mol/L的溴化锂溶液,置于 60 ℃油浴中加热。向溶液中加入 5 g 脱胶蚕丝,低速搅拌反应 4 h。完成反应后,将所得溶液装入事先准备好的 MWCO 3500 透析袋中,去离子水透析 48 h,以去除溶液中的溴化锂。透析完毕后,将溶液转移至离心管中,并在 4 ℃、9 000 r/min离心2次,每次离心 20 min[4]。留取上清液作为最终使用的丝素蛋白溶液。
1.3.2制备丝素蛋白膜 将丝素蛋白溶液均匀地倒入方形培养皿中,然后将培养皿放置在 30 ℃的加热台上蒸发 24 h ,直至完全干燥,形成薄膜。将膜放置于 60 ℃、100%相对湿度的恒温恒湿箱中高温高湿处理 20 min,然后将膜放置于在两块镜面钢之间,使用热压机在 15 MPa、170 ℃的条件下进行热压处理,即可获得丝素蛋白膜。所得的丝素蛋白膜应进行真空干燥保存,以备后续使用。
1.3.3微观表征 将丝素蛋白膜裁剪成规则大小,于液氮中脆断得到样品。选择断面整齐的样品,采用导电胶将其固定于样品台正面及侧面,于低真空度的蒸金室中蒸金 60 s,通过扫描电镜在 2.5kV 加速电压下观察其表面及截面结构特征。取丝素蛋白膜采用傅里叶变换红外光谱仪分析其二级结构。
1.3.4力学性能测试 将丝素蛋白膜裁剪成长条形样品并浸泡于 DPBS 中,待其充分溶胀后使用游标卡尺测量厚度、宽度与长度,样品置于恒温水浴中通过万能力学试验机以 100 mm/min 的拉伸速度匀速拉伸直至样品断裂,以测量其湿态拉伸性能。
1.3.5细胞相容性检测 根据ISO/EN10993-12 国际标准组织的规定,提取丝素蛋白膜浸提液,并将经过高温高压灭菌处理的样品浸泡在含有 10% 胎牛血清和 1% 青-链霉素溶液的培养基中,浸泡时间为 24 h。接种 MC3T3-E1 细胞,每个时间点每组 3 个复孔,每孔接种 1×103个细胞。接种 24 h 后更换培养基,对照组使用普通培养基,丝素蛋白组使用浸提液培养,每 3 d 换液 1 次。在 1、4、7 d 分别弃去培养基,PBS 清洗,每孔加入 CCK-8 溶液,37 ℃ 孵育 1 h 后使用酶标仪读取450 nm处吸光度值。
1.3.6细胞活力实验 通过活/死荧光染色评估细胞活力:使用打孔器将丝素蛋白膜制备成直径 6 mm的圆形样品,高压蒸汽灭菌,分别置于 3 个 96 孔板中,每个样品上接种 3×103个 L929 细胞,每个时间点设 3 个复孔。分别培养 4、7 d 后按照活死细胞染色试剂盒使用说明书染色,使用荧光倒置显微镜观察并拍摄样品。
1.3.7细胞黏附实验 将 MC3T3-E1 细胞接种于丝素蛋白膜,4 d 后取出,PBS 溶液洗涤 3 次,用 4% 多聚甲醛固定 40 min 后再次使用 PBS 洗涤,每次 5 min 。使用不同浓度的乙醇溶液进行梯度脱水(乙醇溶液的浓度依次为 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 和 100%),每个梯度脱水 10 min 。脱水完毕后用叔丁醇清洗薄膜 3 次,置换出乙醇后使用冷冻干燥机将薄膜样品冻干,用于扫描电镜观察。
1.3.8细胞成骨分化的检测 将消毒后的丝素蛋白膜浸泡于成骨诱导培养基内 24 h,获得浸提液。将 MC3T3-E1 接种于 12 孔板内,24 h 后更换为相应浸提液培养基,每 3 d换液 1 次, 7 d 后按照 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色剂说明书进行染色以检测 ALP 活性。
1.3.9溶胀及降解性能测试 溶胀测试:将丝素蛋白膜裁剪成 5 mm×15 mm 的条形样品,60 ℃ 烘干后称量原始质量,然后将样品完全浸没于 DPBS 中,分别于 0.25、0.5、1、1.5、6、12、24、48、72 h 后取出,用滤纸吸去样品表面的液体后称重,定量变化表示为相对于初始干重溶胀后重量的百分比。
降解性能测试:将丝素蛋白膜制成规则的条形样品,烘干后用分析天平测量样品干重,丝素蛋白膜(每组n=3)浸没在含或不含 0.1 U/L蛋白酶 K 的 DPBS 溶液中,在 37 ℃摇床中温育0.5、1、3、6、12 h,每个时间段更换新鲜降解液,将降解的产物收集后在去离子水中漂洗并真空抽滤,60 ℃下干燥后称量干重。定量变化表示为相对于初始干重残留的重量的百分比。
2.1 丝素蛋白膜的结构表征及成分分析扫描电镜可见丝素蛋白膜表面平整(图 1A),截面可见其结构致密,厚度约为 90 μm(图 1B)。如图 2C 所示,未保湿、热压的丝素蛋白膜的红外吸收峰在 1 637 cm-1、1 514 cm-1处,分别表示随机卷曲、α-螺旋中氨基酸残基的 C=O 键振动和 β-折叠结构中氨基酸残基的 N-H 及 C-N 键振动。对膜样品进行高温高湿、热压处理后,新的红外吸收峰出现在 1 699 cm-1处,表明膜样品中出现了新的 C=O 键振动。同时,原先位于1 637 cm-1的 C=O 键振动峰移动至 1 618 cm-1处,并且峰形更加尖锐。以上结果表明高温高湿和热压处理促进了 β-折叠构象的形成。
2.2 湿态条件下自蒸发-热压处理的丝素蛋白膜与甲醇交联的丝素蛋白膜拉伸强度的比较图2显示,在湿态条件下,自蒸发-热压处理的丝素蛋白膜与甲醇交联的丝素蛋白膜在拉伸弹性模量、拉伸强度方面存在显著差异。首先,自蒸发-热压处理的丝素蛋白膜的拉伸弹性模量为(45±8.19)MPa,而甲醇交联的丝素蛋白膜的拉伸弹性模量为(3.27±0.47)MPa。表明自蒸发-热压处理的丝素蛋白膜具有更高的弹性模量,即在受力后能够更好地恢复到原始形状。自蒸发-热压处理的丝素蛋白膜的拉伸强度为(8.39±0.63)MPa,而甲醇交联的丝素蛋白膜的拉伸强度为(1.48±0.151)MPa。表明自蒸发-热压处理的丝素蛋白膜具有更高的抗拉强度,能够承受更大的拉伸力。以上结果表明自蒸发-热压处理的丝素蛋白膜具有更高的弹性模量、拉伸强度。
图1 丝素蛋白膜的微观形貌和二级结构成分分析
图2 丝素蛋白膜的拉伸机械性能测试
图3 丝素蛋白膜的生物相容性及细胞黏附能力
图4 丝素蛋白膜的促成骨分化能力检测
图5 丝素蛋白膜的溶胀及体外降解性能
2.3 细胞增殖及细胞活力实验根据 CCK-8 法检测结果显示,培养 1、4、7 d 后,空白组和丝素蛋白组之间的吸光度无明显差异(图 3A)。通过倒置荧光显微镜观察活死细胞染色,结果如图 3B所示,活细胞呈现绿色荧光(活),死细胞呈现红色荧光(死)。在共培养 4、7 d 后,空白组和丝素蛋白组表面的活死细胞比例无明显差异。这些结果表明丝素蛋白组对细胞的毒性无明显影响。
2.4 细胞黏附能力MC3T3-E1 接种在丝素蛋白膜表面 4 d 后,扫描电镜结果表明细胞可以较好的黏附在丝素蛋白膜表面(图 3C),且伸出伪足。使用激光扫描共聚焦显微镜观察丝素蛋白膜表面 MC3T3-E1 细胞,图 3D 为细胞核染色图、细胞骨架染色图以及二者的融合图像,可见大量细胞伸展黏附于丝素蛋白膜表面。以上结果表明 MC3T3-E1 细胞对丝素蛋白膜具有良好的黏附性。
2.5 促成骨分化能力成骨诱导 7 d 后,ALP染色实验结果如图 4,与空白组相比,在丝素蛋白组中MC3T3-E1细胞表面显示碱性磷酸酶阳性结果更明显。这表明丝素蛋白的存在确实有一定促成骨作用。
2.6 溶胀性和可降解性溶胀测试结果如图 5,丝素蛋白膜在溶胀初始阶段(1 h 内)溶胀较快,6 h 左右达到溶胀平衡。降解实验表明,在 0.1 U/L 蛋白酶 K 的存在条件下,12 h 时丝素蛋白膜降解率达 35.3% 左右。表明丝素蛋白膜具有一定的溶胀性和可降解性。
GBR 技术是一种使用屏障膜的外科技术,广泛应用于牙周组织再生领域,它的原理是使用屏障膜来防止软组织长入骨缺损区域,并帮助形成新生骨[5]。GBR 膜通常可分为可吸收性膜和不可吸收性膜,临床上常用的可降解 GBR 膜通常基于聚酯或胶原蛋白。聚酯基膜具有可控的降解速率和足够的机械强度,有利于骨缺损区域成骨空间维持,然而,其降解产物可能引发局部炎症反应,不利于骨组织的形成。而胶原基天然膜虽然具有优异的生物相容性,但降解较快,且力学性能较差,可能会导致膜塌陷,影响成骨效果[6]。丝素蛋白是一种常见的天然高分子聚合物,因其免疫原性低、生物相容性优异、降解性能可控,广泛应用于生物医用材料领域[7]。
本实验结合自蒸发技术和热压技术,成功制备了具有优异力学性能的可降解丝素蛋白基 GBR 膜。首先,利用自蒸发技术将丝素蛋白溶液制成平整光滑的膜材,并形成部分结晶。同时引入结合水来维持丝素蛋白的稳定性,水分子与丝素蛋白中的氨基酸残基通过氢键和静电作用相互作用,有利于后续 β-折叠的形成[8]。这种结合水的引入可以调节丝素蛋白的功能,使其具有一定的弹性和可伸缩性,从而有效提高其力学性能。其次,热压处理可以通过热能的输入和压力的作用,使丝素蛋白中的亮氨酸和甘氨酸残基之间的氢键重新组合,从而促进 β-折叠的形成[9]。同时,热压处理还可以改变丝素蛋白的分子排列和结晶度[10]。通过热压处理,丝素蛋白分子可以更加紧密地排列,形成更稳定的结晶态,有利于生成 β-折叠结构。这为制备高模量和高强度的可降解丝素蛋白 GBR 膜提供了理论依据。
既往研究[11-12]表明,丝素蛋白可以促进骨细胞的增殖和分化。它通过调节细胞外基质的合成和分泌,以及激活细胞内信号通路来促进骨细胞的增殖和分化,从而促进新骨的形成[13]。体外生物相容性实验结果显示,实验组与空白对照组结果无明显差异,丝素蛋白基 GBR 膜在体外环境中不引起明显的细胞毒性或不良反应,显示出良好的生物相容性。丝素蛋白基 GBR 膜具有表面光滑且致密的结构,这种致密的结构为膜提供了优良的力学性能。力学拉伸实验结果表明,在湿态下,丝素蛋白基 GBR 膜的抗拉强度可达 8.39 MPa,显著高于市售 Bio-Gide 胶原膜的1.16 MPa[14]。以上实验结果表明,丝素蛋白基 GBR 膜具有优异的生物安全性,并且本研究所述蒸发-热压法,所得 GBR 膜的机械性能具有显著优势。
综上所述,本研究利用自蒸发技术和热压技术成功构建了丝素蛋白基 GBR 膜,并对其微观结构、湿态下的力学性能、溶胀性能、降解性能、细胞相容性及细胞黏附能力等进行了探究。相关实验结果显示,所制备的丝素蛋白基 GBR 膜有望作为新型的 GBR 膜在临床中应用。而未来的研究需要进一步的体内实验证据和长期的生物相容性评估,从而深入探究丝素蛋白基 GBR 膜在骨组织工程中的应用潜力,并进行更全面、系统的生物性能评价。
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