严淋露，庞 博，查穆哈，陈星瑶，康振坤，王 强
(1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，黑龙江哈尔滨 150040；
2.呼伦贝尔市北方寒冷干旱地区内陆湖泊研究院，内蒙古呼伦贝尔 021008；
3.中国科学院东北地理与农业生态研究所，吉林长春 130102)
湿地是地球上生产力和经济价值最高的生态系统之一，它提供了关键的生态系统服务和功能，如碳储存、生物多样性保护、气候调节、水源净化、防洪减灾等[1-3]。湿地是水域和陆地相互作用形成的特殊生态系统，其复杂的水文环境和多样的组成成分使其具有较高的初级生产力和复杂的有机质来源，为鱼类、两栖类、水鸟等众多物种提供了觅食、栖息和繁殖场所，因此在湿地中常常形成复杂的食物网关系[4-5]。湿地食物网不仅反映了湿地物种间的捕食关系和营养物质的流动途径，更描述了生物群落内不同生物体之间复杂的营养互作。随着湿地食物网研究的逐渐深入，可反映系统内物种间营养关系及有机体在食物网中相对位置[6]的营养级研究开始受到生态学家们的广泛关注。
营养级(trophic level)是食物网研究中的一项重要内容。营养级的变化代表了从生产者到消费者能流途径的改变，具体体现在物种摄食行为和饵料生物的丰度变化两个方面[7-8]。早期营养级的研究并没有明确规定评估和计算方法[9]，1975 年，利用消费者的食物组成及其所占比例来计算营养级，之后关于营养级的研究才得到广泛应用[10]。随着稳定同位素技术的推广和应用，1992年，利用“消费者与基线物种氮同位素的差值除以分馏因子，再将所得值加上基线物种营养级值”这一等式关系计算海洋生物的营养级。至此，营养级的研究又有了新的形式和进展[11]，基线物种(baseline species)和分馏因子(trophic discrimination factor，TDF)也成为准确评估物种营养级的关键参数。
在计算营养级时，将基线物种的氮稳定同位素值作为“基准”，以此计算和评估食物网中更高水平生物的营养级。“基准”的作用是校正给定区域同位素水平的固有差异，从而便于进行营养级评估和食物网结构的比较，因此，理想基线物种的同位素值应随时间相对恒定[12-13]。当氮循环过程、温度、光合作用途径等多种因素导致基线物种同位素呈现较高的时空变化时，较高等级消费者的营养级就更多地取决于基线物种采样的时间，而不是消费者具体的饮食情况。有研究表明，湖泊中浮游植物和颗粒有机物(POM)中δ15N 值的时间变化是初级消费者的10倍，因此，分别利用浮游植物和初级消费者作为基线物种计算的食物链长度相差高达8 个营养级[13-14]。因此，选择合适的基线物种对于研究湿地食物网的结构和功能至关重要，对基线物种变化的有限理解会妨碍对消费者稳定同位素的适当解释，并导致对有关物种生态作用的不准确推断。
分馏因子也称为富集因子，是食物消化和同化过程中消费者和其食物之间同位素比率的相对可预测的变化[12]。分馏因子会因不同物种和组织、样品处理方式、食源质量、有机体自身新陈代谢水平等因素而有所不同，较小的分馏因子差异就有可能导致稳定同位素比率对饮食和营养级估计的巨大差异。例如，研究人员利用不同食鱼鸟类的分馏因子来估算燕鸥(Sterna hirundo)饮食中磷虾(Meganyctiphanes norvegica)的百分比，根据设置的分馏因子的不同，结果从10.8%到90.7%不等[15]。还有研究发现，基于相加框架(additive Δ15N framework，两营养级之间的分馏因子是固定常数值)计算出的各物种营养级小于基于尺度框架(scaled Δ15N framework，分馏因子随营养级升高而减小)计算出的各物种营养级[16-17]。因此，选择合适的分馏因子对于准确评估物种在食物网中的营养位置至关重要。
尽管稳定同位素技术已在湿地食物网研究中得到广泛应用，关于物种稳定同位素组成与变化[18]、物种食源组成与变化[19-20]、食物网结构和营养级核算[21-22]等方面已经开展了很多研究，但是，在营养级核算过程中，对基线物种和分馏因子的合理选择以及二者的可变性对营养级评估影响的综合性探究，关注度仍然不足。鉴于此，本研究详细介绍了基于稳定同位素技术计算物种营养级的基本原理，系统总结了常用基线物种和分馏因子的类型及二者的变化特征，并进一步分析了基线物种和分馏因子的变化对营养级评估的影响。旨在科学理解基线物种和分馏因子对于营养级评估的重要性，为准确核算物种营养级以及精准定位物种在生态系统中的营养位置提供更多有益参考。
质子数相同而中子数不同的同一种元素的不同原子互称为同位素，其中，不具有放射性的同位素被称为稳定同位素[23]。在食物网研究中，常用的稳定同位素主要有碳稳定同位素(12C 和13C)和氮稳定同位素(14N 和15N)。物质的稳定同位素组成通常用该物质的重、轻同位素原子丰度之比与标准物质的重、轻同位素原子丰度之比的比率δ表示：
公式(1)中，X为15N、13C 等，R样为所测样品重同位素原子丰度与轻同位素原子丰度的比值，R标为标准物质重同位素原子丰度与轻同位素原子丰度的比值(如13C/12C 或15N/14N)。每种稳定同位素的比值都是相对于标准物质而言的[24-25]。
由于同位素的质量不同，在不同的生化过程中会以不同的比例分配到不同物质中，这种现象叫做同位素分馏，同位素分馏导致消费者与其食物之间稳定同位素比值的差异[26]。碳稳定同位素在食物网的传递过程中比较稳定，消费者与其食物之间的营养分馏约为0‰～1‰[12]，通常用碳稳定同位素进行食物溯源。氮稳定同位素通常在消费者体内富集，消费者与其食物之间的营养分馏约为3‰～4‰[27]，因此常用氮稳定同位素计算营养级，常用的营养级计算公式如下：
公式(2)中，TL为营养级；
δ15N消费者为消费者的氮同位素比值；
δ15N基线为基线物种的氮同位素比值；
当基线物种为初级生产者时，λ=1；
当基线物种为初级消费者时，λ=2；
Δ15N为分馏因子，是物质传递过程中δ15N值在每一个营养级的富集值[28-30]。
上述公式中共存在4 个未知数，分别为营养级、消费者δ15N 值、基线物种δ15N 值和分馏因子。其中前3个参数可以通过实验和计算获得，分馏因子多选择常数值。然而，大量研究发现，基线物种和分馏因子受多种因素的影响，多变的基线物种δ15N 值和分馏因子会导致不同的营养级计算结果。因此，选择合适的基线物种和分馏因子是准确计算物种营养级的前提条件。以下分别从基线物种和分馏因子的变化及其对营养级评估的影响两方面进行探讨。
对于不同湿地生态系统中基线物种的选择，需要根据所研究生态问题的时空背景以及所研究湿地的环境状况、物种组成、时空动态变化等因素来决定。在湿地食物网研究中，基线物种通常为食物网中低营养级的生物或有机物，如初级生产者(藻类)、有机碎屑或初级消费者(浮游动物、底栖动物)。
2.1 藻类
藻类作为生态系统的初级生产者，是湿地食物网的基础碳源，常被作为基线物种应用于湿地食物网研究中。藻类δ15N值易受水文条件、气温、营养物质浓度等多种因素的影响，其δ15N 值的变化还会沿着食物链向上传递，进而影响食物链的长度和食物网的结构。
藻类氮同位素比值的影响因素有很多。首先，不同种类藻类的δ15N 值差异明显。通过分析芬兰西南部1 个中营养湖泊和3 个富营养湖泊中不同藻类的δ15N值，发现不同种类藻类δ15N值之间存在显著差异，其中金藻、甲藻和硅藻的δ15N值变化范围较大，为-2.1‰～12.8‰[31]。其次，湖泊水动力条件的变化会导致藻类δ15N值发生变化。不同的水流流速会改变水流的波动程度，影响藻类的生长繁殖，从而影响藻类的δ15N值[32-33]。底栖藻类δ15N 值还受到太阳辐射[34]、固着厚度[35]等的影响，水温[36]、pH[37]等因素也会通过影响藻类的生长进而影响藻类的δ15N 值。最后，藻类稳定同位素特征随其所处环境而变化，最显著的是随营养物质浓度和形式而变化，但其相关性是非系统的和特定区域的。氮是浮游植物生长繁殖所必需的营养成分，也是影响浮游植物生长的重要因素之一。浮游植物主要吸收铵态氮、硝态氮等溶解性无机氮[38-39]，也可吸收尿素、溶解性的游离氨基酸等小分子有机氮[40-41]，不仅氮源中的15N 含量会影响藻类δ15N 值，氮循环过程更会对藻类δ15N 值产生显著影响，例如，固氮作用、硝化作用会使藻类的δ15N值降低，反硝化作用则会使藻类的δ15N值升高[42-43]。随着城市化进程的加快，高浓度的污染物(生活污水、工业废水、农药化肥等)被更多地排放到湿地生态系统中，增加了氮、磷等营养盐的输入，引起湿地水体富营养化，从而导致藻类δ15N值升高。
藻类最早被用作基线物种来计算营养级，但其δ15N值易受环境因素的影响，具有明显的时空变化特征，因此只有少数研究将藻类作为基线物种用于评估物种的营养级和能流特征。在黑石礁海域进行生物稳定同位素特征和营养级的短期监测时，将孔石莼(Ulva pertusa)作为基线物种，发现六线鱼(Hexagrammos otakii)与孔石莼大约相差2 个营养级[18]。在进行湖泊食物网研究时，将浮游植物作为基线物种计算鱼类营养级，发现抚仙湖敞水区鱼类营养级为2.29～3.66，星云湖敞水区鱼类营养级为2.02～3.55，因为星云湖水体呈富营养化状态，浮游植物密度大，鱼类大量摄入藻类，因此其营养级相对较低[44]。太湖北部湖区人为干扰严重，蓝藻大爆发，以蓝藻作为基线物种计算营养级，发现竺山湖、三国城、乌龟山水域的鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)营养级均在1～2之间，月亮湾鲢、鳙营养级在2～3之间[45]。
综上所述，藻类δ15N 值易受温度、营养物质浓度、水文条件等环境因素的影响，仅适用于短期监测。因此在以藻类作为基线物种计算物种营养级时，环境因素的波动会导致营养级时空差异较大，即同一物种在不同时间、不同地点的营养级计算结果差异显著。为了更准确全面地了解生态系统的功能和结构，准确评估物种营养级，有学者建议通过高时间分辨率、高频率的采样方式来获得样品，从而弄清藻类δ15N值的变化特征，弥补藻类δ15N值的时空变化引起的物种营养级核算偏差[26]。
2.2 浮游动物
浮游动物是湿地食物网中连接基础碳源和高级消费者的重要枢纽[46]。与浮游植物相比，浮游动物作为生态系统的初级消费者，其生命周期较长，对环境波动敏感程度低，浮游动物δ15N值可以反映其在较长时间内的摄食情况。因此，浮游动物δ15N值常被用作湖泊浮游食物网的基线。
将浮游动物作为基线物种时，一般有两种类型，第一种是不区分种类、将体型大小在同一范围内的浮游动物作为基线物种。例如，将个体大小小于250 μm的浮游动物作为基线物种，发现不同湖泊中无脊椎动物捕食者、浮游生物食性鱼类和肉食性鱼类分别比浮游动物高了1 个、2 个和3 个营养级[47]。将第二营养级的草食性浮游动物作为基线物种研究了太湖的食物网结构，发现该系统有4 个营养级[48]。在研究胶州湾普氏栉虾虎鱼(Rhinogobius pflaumi)的摄食习性时，研究人员把中型浮游动物(380～500 μm)作为基线物种，结果显示，普氏栉虾虎鱼的营养级范围为3.49～3.76[49]。这种类型的基线被广泛应用于营养级研究中。
然而，这种方法忽略了不同种类和体型大小的浮游动物δ15N值的不同对营养级评估的影响，众多研究已经证实，不同种类和大小的浮游动物δ15N值差异显著[50-52]。尼斯湖中不同浮游动物种群间的δ15N值差异显著，透明溞(Daphnia hyaline)δ15N值为4.8‰～7.8‰，真镖水蚤(Eudiaptomus gracilis)和 剑 水 蚤(Cyclops abyssorum)δ15N 值 为7.3‰～9.7‰，而位于第三营养级的多刺水蚤(Bythotrephes longimanus)δ15N值为10.2‰～10.4‰[51]。研究人员普遍发现，浮游动物δ15N 值随着其粒径的变大而增大。对南海浮游动物稳定同位素的研究结果显示，大型浮游动物(500 μm)δ15N 值大于中型(380～500 μm)和小型(180～380 μm)浮游动 物[53-54]。黄东海4 个粒径范围(100～200 μm、200～500 μm、500～1 000 μm 和1 000～2 000 μm)浮游动物δ15N 值逐级递增[55]。不同种类和大小浮游动物δ15N值变化的最主要原因是受到不同摄食行为的影响。不同种类的浮游动物可以选择性摄食不同类型的藻类。尼斯湖中甲壳类浮游动物冬季和初春主要食用δ15N 值较高的颗粒有机物，夏季主要摄食δ15N值较低的藻类，导致冬春季的δ15N值比夏季高[51]。另外，浮游动物可以直接摄食鱼饲料或者以鱼饲料为营养盐的浮游植物，这样会引起浮游动物较高的δ15N 值[56]。体型大于500 μm的浮游动物多为凶猛的肉食性动物，喜食甲壳类等中小型浮游动物，故其δ15N值较高；
而200～500 μm的浮游动物主要是杂食性和植食性的桡足类和枝角类，因而其δ15N 值较小[53,55]。研究发现，浮游动物体型大小的不同可能导致湖泊中特定区域浮游动物δ15N 值的变异性较大[57]，从而影响物种营养级的计算结果。利用浮游动物δ15N 平均值作为基线，评估了象山港牧场区物种营养级，象山港黄姑鱼(Nibea albiflora)δ15N 值(10.88‰)比渤海湾(12.39‰)低，象山港黄姑鱼的营养级为3.5 左右，渤海湾黄姑鱼的营养级为3.65±0.39，两者差异的主要原因来自于物种摄食习性和浮游动物食源的变化[58-59]。相似的营养级变化在其他研究中也有所发现，在三亚蜈支洲岛牧场珊瑚礁生态系统中，作为基线物种的浮游动物的种类和营养物质来源不同是导致花斑蛇鲻(Saurida undosquamis) 和大头狗母鱼(Trachinocephalus myops)营养级偏低的重要原因之一[60]。因此，将第一种类型的浮游动物作为基线物种时，其较高的同位素异质性会影响多系统间或单一系统内的比较研究[26]。
浮游动物作为基线物种的另一种类型是使用已知食性的单一种类浮游动物作为在其摄食栖息地的基线物种。例如，利用已知是草食性的桡足类浮游动物作为评估其他杂食性桡足类浮游动物的基线物种[50]，这种方法的优点是基线物种与被评估物种具有相似的生物学特性和同位素变化特征。还有研究发现，专一植食性水蚤(Daphnia)δ15N值的季节变化可作为基线评价鱼类的营养级[52]。选择单一种类的浮游动物并不适用于所有研究，需要根据不同的研究内容和生态系统具体分析[12,52,61]。
综上可知，目前常被用作基线物种的浮游动物主要有两类，一类是不区分浮游动物种类、将体型大小在同一范围内的浮游动物作为基线物种，但是体型和种类不同的浮游动物因其摄食习性的不同而具有不同的δ15N 值，会导致在营养级评估过程中产生误差，另一类是采用已知食性的单一种类浮游动物作为在其摄食栖息地的基线物种。无论采用哪种类型的浮游动物作为基线物种，其δ15N值受食源质量、种间差异、个体大小等一系列因素影响，具有明显的季节和区域变化特征，浮游动物不稳定的δ15N值导致物种营养级评估不准确的问题仍然存在。因此，在利用浮游动物作为基线物种评估物种营养级时，根据所研究的科学问题和区域背景，可以通过增加采样次数，最大限度地涵盖浮游动物δ15N 值因食源质量、个体差异等因素而导致的时空变化，从而降低对营养级评估的影响。
2.3 颗粒有机物
颗粒有机物是湿地生态系统中消费者的重要食物来源，通常包括浮游植物、浮游动物和有机碎屑，对于追踪食物网中的能量流动具有重要作用。从来源上看，颗粒有机物主要由内源性有机物(水生植物、浮游植物等水体中的本土物种)和外源性有机物(陆生植物碎屑、外源输入的有机物)组成[62]。许多生态学家利用颗粒有机物δ15N 值为湿地食物网建立营养基线，以评估消费者和食源之间的摄食关系[50,63-64]。但由于多种因素会对内源性有机物和外源性有机物在颗粒有机物中的组成造成影响，因此颗粒有机物的δ15N 值常因组成成分不同而有所变化[62,65]。
研究人员已经认识到，氮循环过程在控制颗粒有机物δ15N 值中起着关键作用[62]。硝化作用、反硝化作用、固氮作用等经常相互协同或拮抗影响颗粒有机物δ15N值，导致对相关数据的解释变得困难。由于固氮蓝藻在吸收大气中的氮气时，对15N 没有明显分馏[66]，因此主要由固氮蓝藻组成的颗粒有机物δ15N 值接近0‰。研究人员发现史密斯湖中6种固氮蓝绿藻的平均δ15N值为1.0±1.3‰，表明大气氮(δ15N=0‰)提供其代谢所需氮[67]。还有研究人员将瓦乌博格湖中颗粒有机物的低δ15N值归因于蓝藻(Cylindrospermopsissp.)的爆发[68]。芬兰于韦斯屈莱湖中颗粒有机物的15N富集主要因为在硝化作用吸收铵的过程中优先去除了14N[69]。除此之外，影响颗粒有机物δ15N值的因素还有水体中溶解无机氮的形态、湖泊面积的大小、纬度、人类活动、水体富营养化程度等[62,70]。
上述原因导致的颗粒有机物δ15N值的变化会在颗粒有机物作为基线物种时反映在营养级评估结果中。在以颗粒有机物作为基线物种评估三峡库区小江流域鱼类营养级的研究中，各江段平均营养级范围为2.84(高阳)～4.26(渠口)，同一物种在不同江段的营养级不同，究其原因是高阳江段人类活动更密集，导致颗粒有机物δ15N 值明显高于其他江段[71]。吴城镇位于鄱阳湖保护区核心区内，受人类活动影响较小，颗粒有机物和鱼类δ15N值总体偏小，因此以颗粒有机物为基线物种得到的物种营养级也较其他区域小[72]。有学者将初级生产者(颗粒有机物、藻类、水生植物)作为基线物种，计算了鄱阳湖不同流域鱼类的营养级，结果显示鄱阳河段的鱼类营养级均高于海口河段，主要因为鄱阳河段人类污染严重，导致颗粒有机物δ15N值存在显著差异，进而导致鱼类营养级出现差异[73]。在以颗粒有机物为基线物种计算塔戈斯河口物种在不同季节的营养级时发现，夏季水体富营养化严重，蓝藻水华爆发导致物种营养级降低[74]。由此可见，颗粒有机物δ15N 值变化会显著影响营养级变化。
早期将颗粒有机物作为基线物种研究消费者与食物之间关系的诸多研究都是基于单个或几个颗粒有机物样本，但这些样本的δ15N 值仅代表取样期间的变化模式，而颗粒有机物δ15N 值因生物地球化学循环、湖泊面积、人类活动等因素影响具有明显的时空变化，而这些变化又会导致以颗粒有机物为基线获得的物种营养级在同一研究区域的不同采样点或不同采样时间的结果不尽相同，从而影响研究结果的准确性。因此，建议进行合理采样设计，特别是在δ15N值变化较大的区域，增加采样频次，如每两个月或每一个月采样一次[62]。
2.4 底栖无脊椎动物
底栖无脊椎动物是湿地生态系统中的重要类群之一，其作为湿地食物网的重要环节，借助食物链，取食植物、有机碎屑，促进营养物质的分解，然后通过排泄和在沉积物中活动，释放营养盐到水体中，同时其自身又被其他高等动物(如鱼、水鸟等)所捕食，具有承上启下的作用，是湿地物质循环和能量流动的重要参与者[75-78]。
相较于浮游植物，浮游动物δ15N 值易受其生长环境理化因素的影响，底栖无脊椎动物δ15N值更稳定，更能反映栖息地的稳定同位素特征，因此更适合做湿地生态系统食物网研究的基线物种[79]。其中螺类和双壳类因周转率低、能更好地反映栖息地稳定同位素特征，而被作为基线物种应用于湿地食物网研究中[12,80-83]。研究表明，螺类和双壳类分别反映了开放水域和沿岸带的稳定同位素特征，因此适合作为基线物种评估这类生态系统的营养级[12]。以铜锈环棱螺(Bellamya aeruginosa)作为底层营养传递的基线物种，以滤食性河蚬(Corbicula fluminea)作为营养传递的基线物种来计算东太湖各种鱼、虾类的营养级，其中秀丽白虾(Leander modestus)的营养级为1.90，鱼类的最高营养级为3.22[22]。因食性简单且易于采集，红底星螺(Astraea haematraga)被视为亚湾珊瑚礁生态系统食物网结构研究中的基线物种，该系统营养级范围为1.70～3.64[84]。将双壳类(Corbiculaspp.)作为基线物种评估了日本琵琶湖流域22条河流的物种营养级，结果显示虾虎鱼(Rhinogobiussp.)营养级为2.4～3.8，条纹长臂虾(Palaemon paucidens)营养级为2.1～3.4[85]。在河口和潮间带湿地生态系统的研究中，双壳类也被广泛用作基线物种，研究人员分别以青蛤(Cyclina sinensis)和异白樱蛤(Macoma incongrua)作为东营黄河口和烟台西海岸潮间带食物网研究中的基线物种，得到两区域主要生物营养级范围为2.00～3.85、2.00～3.15[21]。螺类和双壳类在多种类型的湿地食物网研究中被广泛用作基线物种，大大提高了生态系统营养级核算的准确性。
底栖无脊椎动物取食范围较固定，活动范围小，生活史周期长，周转率低，对短期的环境波动不太敏感，因而可以避免浮游动植物和颗粒有机物稳定同位素特征值因时空变化而引起的物种营养级改变[12,13,81,86-87]。底栖无脊椎动物δ15N值还因生活环境、种类和食性不同存在波动[88-93]，若将不同种类看作整体取平均值，会影响高营养级评估的准确性，因此，高频次的时间和空间采样对于系统内和系统间的比较研究仍然重要，同时还要考虑种间差异的影响。
食物消化、吸收和同化过程中食物组织和消费者之间同位素比率的相对可预测变化被称为营养分馏，其大小的估计被称为营养分馏因子，由于氮稳定同位素易在营养级之间富集，所以常被用于计算物种营养级，氮稳定同位素的分馏因子用Δ15N表示[12,23]。分馏因子会受到多种因素的影响，目前Δ15N的影响因素主要包括物种类别[94]、年龄[95]、组织类型[96]、代谢状态[97]、同化和排泄的差异[98]、水温[99]、食源质量(蛋白质、糖类、脂质等)和食源稳定同位素组成[100-104]。选择不准确的分馏因子会导致所计算的消费者营养级有所不同，从而影响食物网结构及相应生态问题的研究，最终影响保护和管理决策的制定。目前常用的分馏因子主要包括具体数值的常数值分馏因子和随营养级变化的变化值分馏因子，以下分别从这两种类型的分馏因子进行分析。
3.1 常数值分馏因子
氮稳定同位素在物种营养级之间富集的研究开展较早，1967年，研究人员首次发现了Δ15N值在食物网中随着营养级升高而增大的现象[105]；
1981年，第一次通过室内实验证明了这一结果[106]；
随后，有学者提出Δ15N值介于1.3‰～5.3‰之间[107]。研究中获得营养分馏因子的方法主要有两种：一种是通过实验获得，在室内严格控制的条件下，测得实验对象与其单一饵料之间的氮同位素差值。例如，在对黑腹滨鹬(Calidris alpina)的控制实验中发现其血浆的Δ15N值为3.5‰[108]；
在鳀鱼的合成饵料喂养实验中测得鳀鱼的Δ15N值为2.5‰，并应用于黄海和东海主要鱼类营养级的计算[109]。室内实验严格控制了实验对象、饵料成分和栖息环境条件，但室内条件下生物的新陈代谢状态、饵料吸收情况、生活环境等与自然条件下存在很大差异，很难获取生物在自然状态下的真实分馏因子。因此，另外一种获得营养分馏因子的方式则是选择野外食性相对简单的物种，测定其组织与食物之间氮稳定同位素的差异。通过比较虾蟹与浮游动物、梭鱼与浮游动物等具有主要摄食关系的生物之间的平均氮稳定同位素差异，得到渤海湾水生食物网的分馏因子为3.8‰，并计算出渤海湾鱼类营养级为3.01～3.88[59]，这与中纬度淡水湖的分馏因子一致[110]。流沙湾翡翠贻贝(Perna viridis)与其主要食源(对虾类、梭子蟹类)的δ15N 平均值的差值为2.57‰[111]，与在控制实验条件下得到的氮稳定同位素的差值2.5‰相近[109]，因此，为了方便比较和计算，采用2.5‰作为其分馏因子。这种方法仅适用于野外食性相对简单的物种。
目前被生态学家广为认可的是采用多个分馏因子的平均值作为动物食性研究的分馏因子。结合前人的研究结果，对不同环境(包括淡水、海洋和陆地)中采集的多种动物(从桡足类到北极熊)进行研究，得出这些物种分馏因子的平均值为3.4‰，并被广泛应用于之后的研究中[12]。例如，采用3.4‰作为分馏因子，研究兴凯湖东方白鹳食物网，得到物种营养级范围为2～3.88[112]；
在北美洲伊利湖物种营养级研究中，也采用3.4‰作为分馏因子，计算得到黄鲈鱼(Perca flavescens)的营养级为2.9～3.7，白鲈鱼(Morone Americana)的营养级为3.1～3.9[113]；
在研究海南东寨港红树林湿地水生食物网结构时，采用3.4‰作为分馏因子，计算了不同物种的营养级，发现虾蟹营养级最低[114]。3.4‰是一个平均在多个营养途径的有效近似分馏值，适用于拥有多个物种和多个营养途径的食物网，但在单一的营养转移或仅有几个摄食链接的研究中并不适用[115]。
3.2 变化值分馏因子
在分馏因子的众多影响因素中，食源质量是一个关键因素。控制实验和Meta 分析表明，Δ15N值与食源δ15N 值呈显著反比关系[94,100,116]。用单一和混合饮食饲喂棕熊(Ursus arctos horribilis)、美洲黑熊(Uusus americanus)和北极熊(Ursus maritimus)，发现熊血浆中δ15N值的变化范围在3.2‰～5.0‰之间[117]。利用营养质量相同但稳定同位素组成不同的食源饲喂杂食性黑家鼠(Rattus rattus)，发现Δ15N值随着食源δ15N 的增加而减小，由此提出可以通过回归方程来估计食源同位素比率对Δ15N值的影响[100]。对哺乳动物和鸟类的研究同样发现，Δ15N值随着饮食质量增加而减小，即肉食性动物因摄入较多高蛋白食物而比草食性动物有较低的Δ15N值[116]。研究发现，孔雀鱼(Poecilia reticulate)的Δ15N值[118]与其他研究的结果[100,116]较为一致。因此，如果使用常数分馏因子(3.4‰)，而忽略了食源δ15N值对Δ15N 值的影响，可能会低估顶级捕食者的营养级，压缩食物链的长度。
随着更多研究的开展，从包含多种物种的数据库中收集数据并进行Meta分析，发现随着食物网营养级的增加Δ15N 值会变小，提出了基于食源δ15N 值的Δ15N 尺度框架来计算物种的营养级的方法[16]。根据Δ15N 尺度框架计算的鱼类营养级与已知的摄食关系一致，而根据常数值分馏因子(3.4‰)得到的物种营养级导致食物网模型是相加的，尺度框架大大增加了基于相加框架计算营养级的准确性[16]。尺度框架也被广泛应用于湿地食物网研究中。例如，利用相加框架和尺度框架，计算兴凯湖8 个物种的营养级以及各物种两种框架营养级之差(ΔTL)，发现黑斑狗鱼(Esox reicherti)的ΔTL最大，为3.97，随着营养级的升高，ΔTL值减小[17]。在研究大亚湾主要渔业生物的营养级时，分别应用相加框架和尺度框架进行计算，结果发现，当营养级低于3.58 时，采用相加框架计算的营养级略高于尺度框架；
当营养级高于3.58时，采用相加框架计算的营养级略低于尺度框架[119]。河口生态系统地理位置和动态特征独特，物质流动性强，因此采用尺度框架评估该系统物种的营养级，结果表明，非汛期主要消费者的营养级普遍高于汛期[120]。由此可见，利用基于食源的尺度框架计算营养级，可以提高大型鱼类的营养级，延长食物链的长度，能够更好地表征食物网内物种间的相互作用。
综上所述，常数值分馏因子虽然被广泛应用于营养级评估中，但由于分馏因子往往会受到物种类别、组织、新陈代谢水平以及食源质量、食源同位素组成等因素的影响，分馏因子的不当使用，可能会低估顶级捕食者的营养级，压缩食物链的长度，导致评估的物种营养级和食物网结构产生偏差。尺度框架整合了食源对分馏因子的影响，基于尺度框架计算的营养级与物种实际的摄食行为相近，能够准确反映生态系统的营养结构。
基线物种和分馏因子是借助稳定同位素技术研究物种营养级的重要参数。目前湿地食物网研究中普遍应用的基线物种包括浮游植物、浮游动物、颗粒有机物和底栖无脊椎动物4 类。其中浮游植物、浮游动物和颗粒有机物因周转率高、栖息环境变化等因素的影响，其δ15N 值具有显著的时空变化，而底栖无脊椎动物能够长期稳定存在、周转率低，其δ15N 值较为稳定，时空变化不明显，能更好地反映栖息地的稳定同位素特征。分馏因子大致可以分为两类，一类是常数值分馏因子，包括通过控制实验获得的单个物种的分馏因子和被广泛应用的多个营养途径的平均值3.4‰；
另一类是变化值分馏因子，通过实验和对多个物种进行Meta分析，得到基于食源的δ15N值的Δ15N尺度框架。
未来，研究人员在借助稳定同位素技术研究物种营养级时，应结合具体科学问题，充分考虑基线物种和分馏因子的可变性及其对营养级评估的影响。若进行短期监测，周转率高、易受环境变化影响的浮游动植物和颗粒有机物更适合作为基线物种，以反映同位素基线的短期局部度量；
若进行长期监测，食性简单、周转率低、对环境变化响应缓慢的底栖无脊椎动物更适合作为基线物种用于评估营养级。相较于常数值分馏因子，基于食源δ15N 值的Δ15N 尺度框架更贴近物种真实的自然状态，因此，在选择合适的分馏因子核算物种营养级时，更推荐使用尺度框架。基于研究目的和研究内容，选择合适的基线物种和分馏因子是未来解决湿地生态系统物质循环、能量流动以及物种营养级相关科学问题的关键。
