张 丹,邓 彪,刘业强,齐金岗,刘润泽,王路路,郑 平,4,杜路淼,王露儒,秦 源,4,王小媚
(1 广西农业科学院园艺研究所,南宁,530007;2 福建农林大学生命科学学院,福州,350002;3 福建农林大学海峡联合研究院,福州,350002;4 福建农林大学平潭科技研究院,福州,350400)
菠萝Ananascomosus(L.) Merr.又称凤梨,属于凤梨科(Bromeliaceae)凤梨属多年生草本植物,是世界四大热带水果之一。菠萝原产于南美洲巴西、阿根廷等热带雨林地区[1],于16世纪引入中国后,在海南、广西、广东、福建、云南、台湾等地广泛种植,菠萝果实因其独特的风味香气和较高的营养价值备受消费者青睐[2]。菠萝不仅可以鲜食,也可用于加工罐头、果脯、果酱、果酒,也是提取菠萝蛋白酶等的重要原材料,国际贸易活跃。
菠萝作为我国热区重要的经济果树,其产量和质量直接影响产业效益和产业发展。我国是世界菠萝生产大国之一,但是由于我国菠萝种植地区属于北缘产区,冬季会周期性地受到霜冻和寒害威胁,成为影响我国菠萝生产的重要因素;而苗期或花果期能否抵御冬季低温是菠萝周年稳定生产的限制因素之一[3]。因此,了解菠萝在低温环境下的响应机制对于提高菠萝抗寒性,保障产量及提高品质具有重要意义。本文主要对菠萝抗寒种质资源,抗寒生理机制、分子机制以及防冻措施等方面进行综述,以期为菠萝抗寒性状的遗传改良提供依据,也为菠萝田间防寒害冻害提供参考。
低温是限制植物种植范围及其生物产量的重要环境因素,它是各国农业生产中的严重自然灾害之一[4-5]。低温会对植物生长发育产生不利影响,从而限制作物及其品种的分布[6]。低温对植物造成的伤害可分为寒害和冻害(见图1)。寒害影响植物光合作用,抑制细胞内酶活性,活性氧和内源激素失衡,严重时甚至引起细胞死亡[7]。冻害会引起植物内部结冰,冰晶会刺破细胞膜,从而导致细胞脱水,最终导致细胞死亡及组织坏死,甚至可引起植物死亡[8]。
图1 田间菠萝寒害和冻害比较
1.1 寒害
菠萝喜温暖湿润,忌低温霜冻。日平均气温15 ℃是菠萝正常生长的临界温度,5 ℃为菠萝寒害临界温度,持续3 d,菠萝就会受到寒害[9-11]。研究表明,寒害会降低菠萝叶绿素含量,从而降低植物光合作用速率[3],也改变细胞膜通透性,破坏细胞内外离子平衡,降低细胞内酶活性,打破内源激素(细胞分裂素、生长素、赤霉素、脱落酸、乙烯等)平衡,甚至导致细胞死亡[7]。田间观察发现,当日平均气温低于8 ℃,连续3 d以下时,菠萝受低温伤害较轻;连续3 d以上,菠萝表现寒害症状,叶片出现褪绿斑,严重时叶片组织坏死,尾部焦枯;连续5 d以上,菠萝茎上分生组织出现坏死褐点,严重时分生组织及周围叶基腐烂[12]。Bartholomew等[13]发现,3 ℃持续24 h以上时,大部分菠萝品种都会出现生长点、心叶基部、花蕾或幼果不同程度腐烂或停止生长发育的现象(见图2)。
图2 菠萝寒害或冻害症状
1.2 冻害
气温降至0 ℃或以下,菠萝叶片组织结冰而受害为冻害。冻害时,菠萝叶片受害部分类似开水烫伤状,同时失去膨压,很快变白干枯[9]。菠萝在抽蕾期受冻害程度较轻时,会出现闭花和自然封顶现象,导致果实发育不正常;冻害程度中等时,花蕾中部以上小花受害,小果不发育,出现畸形果,造成大幅度减产;冻害程度严重时,花蕾和嫩茎腐烂,甚至整株腐烂死亡。越冬果实受冻寒程度较轻时,果实品质下降、小果开裂和果实硬化,严重时受害部位腐烂或全果腐烂[12]。南宁市1976年1月出现连续7 d的低温阴雨(最低温1.7 ℃),并且出现霜冻天气,导致菲律宾菠萝品种叶面和株心出现结冰现象,叶片大部分干枯死亡,部分生长点冻坏,心叶腐烂,果实黑心结冰、变质霉烂[9](见图2)。
2.1 菠萝抗寒性鉴定方法
主要有形态学指标评价法和生理生化指标测定评价法2种方法。植物形态学指标可以直观地反应其受低温胁迫的程度。刘荣光等[12]将菠萝寒害划分为7个等级,即0级,叶片生长正常,无寒害或冻害迹象;1级,叶片上有寒害斑点或少数叶尖干枯(干枯长度10 cm以内);2级,寒冻害明显,多数叶片失水干枯,干枯长度占叶片总长的1/3以下;3级,多数叶片失水干枯,干枯长度占叶片总长的1/2以下;4级,多数叶片失水干枯,干枯长度占叶片总长的1/2以上;5级,株心腐烂或叶片完全枯萎;6级,茎部腐烂,全株死亡,在此基础上可以一定程度上推断菠萝抗寒性。此外,研究者也发现植物叶片组织结构与植物抗寒性关系密切,如叶片的表皮细胞和角质层厚度,叶片纤维束、维管束、韧皮部、木质部的直径及韧皮部、木质部的气腔大小,单个气孔面积大小和气孔密度等。邹雪娟等[14]发现抗寒性较强的菠萝植株叶片的表皮细胞和角质层相对较厚,叶片纤维束、维管束、韧皮部、木质部的直径和韧皮部、木质部的气腔相对较小,抗寒性较弱的品种的叶片结构则相反。李映晖等[15]根据“巴厘”“台农17号”“澳大利亚卡因”叶片气孔特征和田间抗寒性调查发现,菠萝叶片气孔特征与抗寒性具有一定相关性,单个气孔面积大和气孔密度小的菠萝品种抗寒能力强,反之亦然。故而,叶片组织结构可以作为鉴定菠萝抗寒性的指标。
低温影响植物的细胞膜结构、渗透调节物质、保护酶系统以及光合作用。细胞膜膜脂的不饱和脂肪酸含量与植物抗寒性相关。郭金栓等发现菠萝叶膜脂脂肪酸组成可以影响菠萝植株抗寒性,其叶膜脂脂肪酸不饱和度越高,抗寒能力越强,反之亦然;并且低温锻炼可以提高菠萝叶膜脂脂肪酸不饱和度,从而提高菠萝耐寒性[16]。低温胁迫会诱导活性氧(包括过氧化氢、氧离子、氧自由基等)的大量产生和积累,这会对细胞造成氧化损伤,在这个过程中会产生丙二醛来影响细胞膜的通透性[17]。因此,在低温胁迫下测定植物相关的生理生化指标,可以鉴定不同植物品种的耐寒性。常用指标包括可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、丙二醛、抗坏血酸、叶绿素含量,过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性等[15,18]。该方法简单易操作,已经广泛应用于多种植物抗寒性鉴定。
低温半致死温度已被广泛应用于评价植物抗寒性,如马铃薯[19]、草莓[20]等。一般采用相对电导率和Logistics方程方法来确定植物的低温半致死温度,且半致死温度与抗寒能力呈负相关[21]。徐志强[21]利用电导法来测定“神湾”菠萝初选的抗寒细胞株系的半致死温度,发现两个抗寒细胞株系的半致死温度分别为-2.34 ℃和-4.43 ℃,而普通“神湾”细胞株系的半致死温度为-1.92 ℃,说明抗寒细胞株系的抗寒能力较强。
2.2 菠萝抗寒品种的筛选与鉴定
菠萝可分为卡因类、皇后类、西班牙类和杂交类4个类群[22]。目前,全球可食用菠萝品种约有100多个,世界菠萝主栽品种包括卡因类的“Cayenne”、西班牙类的“Singapore Spanish”、皇后类的“Queen”等品种[23]。国内菠萝种植以皇后类的“巴厘”、卡因类的“无刺卡因”以及台湾育成“台农系列”杂交类品种为主。通过栽培适应性观察与种质抗寒性鉴定发现,“无刺卡因”“巴厘”的抗寒能力中等[11]。“金菠萝”又称“MD-2”,是美国夏威夷菠萝研究所以“无刺卡因”为亲本杂交选育的品种,该品种糖和抗坏血酸含量较高,且“金菠萝”抗寒能力比“无刺卡因”“巴厘”强[16,23]。刘胜辉等[11]根据菠萝叶片寒害分级对30份菠萝种质资源耐寒性进行评价发现,国外引入种质资源的抗寒性比国内种质资源的抗寒性强,其中澳大利亚的“金菠萝”“MacGregor”“Maroochy New”等品种的抗寒能力最强(见表1)。陆新华等[18]对10份菠萝种质幼苗进行低温胁迫后,采用生理生化指标测定结合主成分分析法和聚类分析其抗寒性发现,“MD-2”“巴厘突变体”的抗寒能力最强,“巴厘”“无刺卡因”“台农16号”“台农17号”“台农19号”的抗寒能力中等,“珍珠”“台农6号”“台农13号”的抗寒能力最弱。冯少锋等[24]对3个菠萝品种进行生理生化指标测定结合寒害等级划分,将“巴厘”“台农17号”划分为1级寒害,“澳大利亚卡因”划分为2级寒害。李映晖等[15]对3个菠萝品种进行低温胁迫,观察其叶片气孔特征,发现其抗寒性从高到低依次为“巴厘”>“台农17号”> “澳大利亚卡因”,与冯少锋等[24]的结果一致。马帅鹏等[25]采用形态学指标和生理生化指标对4个菠萝品种进行寒害调查发现,“金菠萝”“卡因”的抗寒能力较强,“黄金菠萝”“巴厘”的抗寒能力相对较弱。进行不同菠萝品种抗寒鉴定,确定品种间的抗寒性差异,对选择适应性品种进行区域规划、布局及引进栽培具有重要的生产指导意义。
表1 不同菠萝品种抗寒性比较
3.1 低温胁迫与活性氧清除机制
低温胁迫会导致植物细胞内活性氧积累,从而引起细胞氧化损伤,这些活性氧必须及时清除,才能减轻低温胁迫伤害。在植物体内,活性氧清除机制包括酶促和非酶促两种类型。酶促脱毒系统包含过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等,非酶类抗氧化剂包含抗坏血酸、谷胱甘肽、类黄酮和甘露醇,这些酶和非酶类抗氧化剂可以有效清楚植物细胞内的活性氧,减轻低温引起的氧化损伤[26]。刘传和等[27]对不同菠萝品种进行低温处理后,发现POD、SOD、CAT基因的相对表达量显著升高,而ProDH(脯氨酸脱氢酶)基因的相对表达量则显著降低。该结果与生理生化指标一致,说明这些抗氧化酶基因在菠萝抗寒过程中扮演着重要角色。冯少锋等[24]发现随着处理温度降低,菠萝品种的抗坏血酸含量呈下降趋势。总之,菠萝抗寒性与活性氧清除机制密切相关。
3.2 低温胁迫与渗透调节物质
低温胁迫会造成植物细胞膜透性增加,细胞内电解质外渗,造成细胞内渗透压失衡。可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸等其他渗透调节物质的积累有利于维持细胞内外渗透平衡,保证细胞生理功能,从而提高菠萝对低温的适应性[24]。陆新华等对10个菠萝品种幼苗进行低温处理,发现5 ℃下随着处理时间延长,所有菠萝品种叶片细胞膜通透性、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量增加;且耐寒性强的菠萝品种的膜相对透性、脯氨酸含量和可溶性糖含量增加的趋势远大于耐寒性弱的品种[28]。此外,低温胁迫还会导致菠萝生长抑制,如叶绿素含量下降、光合作用减弱等。
菠萝抗寒相关基因和调控机制的研究日益受到关注,目前国内外关于菠萝抗寒调控分子机制的研究较少,主要集中在菠萝抗寒性相关基因的初步筛选(见表2)。
表2 菠萝抗寒相关候选基因及功能
4.1 转录组和代谢组水平
菠萝在低温胁迫下会调节一系列基因的表达以适应寒冷环境。转录组学和代谢组学等高通量技术的应用为菠萝抗寒途径的研究提供了重要手段。Chen等[29]通过转录组学的方法,分析出与细胞壁特性、气孔关闭、脱落酸(ABA)和活性氧(ROS)信号转导相关的基因对菠萝耐寒性有一定的影响;同时,他还以冷冻保护蛋白(CORs)为切入点预测了一系列参与菠萝抗寒响应调控网络的候选基因,如MYB73、ZAT10等。刘传和等[30]通过分析不同品种菠萝植株在低温胁迫下的转录组和代谢组,共筛选出20个与菠萝抗逆性相关的基因,包括WRKY、MYB家族基因,及脱落酸胁迫诱导成熟蛋白ASR3,超氧化物歧化酶SOD1,过氧化物酶POD48,热激蛋白HSP20,谷胱甘肽S-转移酶GSTF1、GSTU17等基因;还分析出菠萝抗逆性与氨基酸类、黄酮类物质的合成以及代谢有关。此外,刘传和等[31]还通过转录组与代谢组联合分析菠萝网纱覆盖的防寒机制,筛选出19个与菠萝防寒相关的候选关键基因,包括WRKY、MYB、bHLH等家族基因,ERD6-like、β-葡萄糖苷酶等基因,以及差异代谢物主要富集在黄酮类、嘌呤、嘧啶、氨基酸类和脂类代谢4条代谢通路。这些关键的差异表达基因和相关代谢通路为进一步深入理解菠萝抗寒途径提供了重要线索。
4.2 菠萝抗寒性相关基因的鉴定与分析
随着越来越多基因家族在菠萝中被鉴定和分析,一些可能参与低温胁迫的相关基因也被发现。DREB基因家族在低温胁迫下被激活,参与调控抗寒相关基因的表达。一些DREB基因的表达水平在低温处理(4 ℃)下上调,如AcoDREB01、AcoDREB03和AcoDREB18能迅速响应低温胁迫[32]。WRKY家族在许多物种中参与非生物胁迫耐受性的调节。Xie等[33]对54个WRKY基因进行鉴定和分析,基于菠萝冷胁迫的转录组数据和qRT-PCR分析验证,发现与拟南芥中冷应答AtWRKY33基因同源的AcWRKY9和AcWRKY52基因的表达被显著诱导,以及与水稻抗寒相关的OsWRKY76基因同源的AcWRKY2基因也受到冷胁迫诱导,说明它们可能在菠萝冷胁迫调控中发挥作用。这个结果说明了DERB转录因子和WRKY转录因子与菠萝耐寒性的潜在相关性。在菠萝植株中过表达脂肪酸去饱和酶基因AcoFAD2,可显著提高其在低温胁迫下的生长速率和抗寒能力[34]。AcoLFY1基因在低温胁迫下的表达水平显著升高,表明其可能以正向调控的方式参与菠萝对低温的应答[35]。菠萝的CBLs(钙调磷酸酶B类蛋白)相互作用蛋白激酶AcCIPK5基因可以正调控拟南芥的耐寒性,并且其表达可影响ABA(脱落酸)相关基因和ROS(活性氧)稳态,说明AcCIPK5基因有潜力用于抗性作物的开发[36]。李穆等[37]发现AcoMYB1基因可在菠萝受低温胁迫时被诱导表达,且呈现先升后降的趋势,故而AcoMYB1基因被推测为正调控因子参与菠萝低温胁迫响应。谭秦亮等[38]发现AcoNAC1基因的表达可受低温胁迫诱导,说明其参与了菠萝低温胁迫的调控响应。这些响应低温胁迫的关键基因具有参与调控菠萝抗寒性的潜力,进一步研究这些基因为提高菠萝抗寒性增加了可能性。此外,其他一些与抗寒相关基因家族如ERF、bHLH、bZIP等在菠萝中的鉴定和分析为我们理解菠萝抗寒机制提供了重要参考。未来的研究可以进一步探究菠萝抗寒途径的调控网络,挖掘和利用新的抗寒相关基因,为菠萝品种耐寒性改良和抗寒品种培育提供更多科学依据。
5.1 物理措施
物理措施有烟熏、束叶和培土盖草等。烟熏是根据天气预报,在低温来临前,利用菠萝园内枯叶和杂草等进行烟熏升温。烟熏时发烟量越大,烟雾越浓,升温效果越好,烟雾可以增大空气中的颗粒物含量,大颗粒尘埃可以加强大气逆辐射,提高地面温度;燃烧产生烟雾的同时也产生大量二氧化碳,也可以起到保温作用[9]。
束叶是利用稻草把菠萝叶片竖扎起来,捆紧封顶,减少叶片与冷空气接触面积,保护植株嫩叶和生长点;如果菠萝植株已经结果,果实用纸袋套袋可以阻隔水汽凝结在果实表面,这不仅可以很好地应对冷雨天气,而且还可以防止果实被蟋蟀等田间害虫啃食等[39]。
培土盖草是在冬季寒潮天气来临前,先用火烧土、塘泥覆盖在菠萝植株根部周围原有土壤表面,然后再覆盖一层厚度约8～10 cm的枯稻草或其他杂草,防止寒风、冷雨和冰霜直接接触生长点和叶片[23,40]。
5.2 化学措施
化学措施主要有施肥和喷施植物防冻剂。
定植前施足基肥,冬季停止使用氮肥,增施磷钾肥。一般在菠萝根部淋施高效生物磷钾肥,每株约80～100 g,同时在叶面配合补充喷施高效生物磷钾肥500～600倍液或0.3%～0.5%磷酸二氢钾液,间隔7～10 d均匀喷湿叶片1次,共2～3次,能够有效增强菠萝抗寒越冬能力[7,41-42]。
植物防冻剂一般通过提高机体自身营养水平或诱导植物产生低温应激反应,从而提高植物抗寒性[43]。在寒潮来临前一周,喷施植物防冻剂,如植物生长调节剂类、有机化合物类、无机盐类、植物提取物类和复合型抗寒调节物质,可以有效增加植物防寒性[44-45]。
5.3 抗寒育种
培育抗寒品种是减轻低温伤害的有效手段。抗寒育种主要通过杂交育种、诱变选种、体细胞无性系变异育种和基因工程育种等方式筛选抗寒能力较强的菠萝植株。
杂交育种主要通过不同品种菠萝人工杂交,并对杂交后代进行无性系筛选[46],这是菠萝主要常规育种方式。美国夏威夷菠萝研究所用“无刺卡因”作为亲本杂交选育出“MD-2”,“MD-2”果实的糖和抗坏血酸含量较高[47]。我国菠萝杂交育种方面也取得较大进展,如我国台湾地区选育的“台农”系列,大陆地区选育的“粤脆”“粤彤”“粤甜”等[12,48],已在生产上推广应用。但是杂交育种存在效率较低、工作量大、耗时耗力,选育周期长等缺点[23]。
诱变选种是通过物理因素或化学因素诱发突变后选育获得新品种[49]。目前主要的诱变方法有甲基磺酸乙酯(EMS)诱变,但目前没有诱变育种的新品种报道[23]。此外,菠萝自然变异(芽变)在生产中发生较多,“金香菠萝”就是从“巴厘”中采用营养系选种方法选育的新品种,与“巴厘”相比具有更好的抗寒性[50]。
体细胞无性系变异一般指植物细胞、组织和器官培养过程中,培养细胞和再生植物产生遗传或表观遗传学变异[51]。徐志强[21]在菠萝细胞株系中筛选出3个抗寒细胞株系,其在形态、细胞及分子水平上发生了不同程度的变异,且它们抗寒能力明显强于普通的“神湾”株系。
基因工程育种能够定向改变菠萝的某个性状并保留其他性状,提高育种的目的性和可操作性。舒海燕等发现在菠萝中转化脂肪酸去饱和酶基因AcoFAD2可以提高菠萝植株的抗寒能力[34]。与杂交育种相比,基因工程育种具有高效、定向以及周期短等特点。
虽然菠萝抗寒性研究取得一些进展,但仍存在许多问题有待解决,这些问题限制了我们对菠萝抗寒机制的全面理解。当前研究中存在的不足主要有4个方面:(1)缺乏系统性研究。目前菠萝响应低温研究多为单一基因或生理指标分析,缺乏系统性和综合性的研究。低温胁迫下菠萝生理、生化和分子机制之间的相互作用和调控网络仍不完全清楚。因此需要开展更全面、更深入地研究,包括转录组学、蛋白质组学和代谢组学等综合分析,以完整揭示菠萝抗寒机制。(2)基因功能和调控机制解析不够深入。虽然已鉴定出部分菠萝抗寒相关基因,但这些基因功能和调控机制解析不完全,有必要进一步分析这些基因在菠萝抗寒反应中的具体作用和相互关系,揭示菠萝抗寒反应分子机制。此外,对非编码RNA、蛋白质修饰和表观遗传等方面的研究将有助于全面理解菠萝抗寒响应的调控网络。(3)缺乏抗寒性强的菠萝品种。目前生产上仍缺乏抗寒性强的菠萝品种。菠萝抗寒性是多个基因参与的复杂调控网络,对这些基因的理解还相对有限。因此,培育高抗寒菠萝品种是重要挑战。需要结合对菠萝基因资源和遗传多样性的深入研究,利用基因编辑和遗传改良等技术手段筛选和培育高抗寒菠萝品种,提高菠萝植物在寒冷地区的适应性和稳定性。(4)缺乏菠萝响应低温的差异性分析。菠萝作为一种广泛分布的作物,不同地理环境和品种之间存在差异,当前研究对地理环境和品种差异分析较少,研究成果应用于菠萝种植实践需要进行实地验证和应用,需与农业生产者和农业政策制定者密切合作,促进研究成果有效转化。另外,应该结合优质菠萝品种选育和种植管理技术改进探索提高菠萝抗寒性和减少寒害风险的综合策略。
总之,未来的菠萝响应低温研究将侧重于基因组学和转录组学的应用、分子机制的深入探究、遗传改良与品种筛选以及综合应用与实践验证,这些研究将为菠萝抗寒性提升提供科技支撑,促进菠萝在不同地区和气候条件下的适应性和生产稳定性,推动菠萝产业可持续发展。
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