毛欣童，刘立明，王九龙，刘 琰，吴艳庆，姜宏利，徐文刚*
(1.烟台大学海洋学院，山东 烟台 264005；
2.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；
3.烟台普胜水产有限公司，山东 烟台 264100)
绿鳍马面鲀(Thamnaconusmodestus)隶属鲀形目(Tetraodontiformes)、单角鲀科(Monacanthidae)、马面鲀属(Thamnaconus)，广泛分布于中国东海和黄渤海、韩国沿岸海域以及日本北海道等地[1-3]，一般栖息于水深50～110 m、水温10～28 °C的近海海域[4-5]。绿鳍马面鲀体型侧扁，头部与马面相似，且食用前需要将鱼皮剥去，故又被称为剥皮鱼、象皮鱼、面包鱼、马面鱼、扒皮狼等[6-7]。绿鳍马面鲀味道鲜美、营养丰富，具有较高的经济价值[8]，曾经是中国渔捞历史上的大宗渔业产品，二十世纪七八十年代年捕捞量一度高达25×104t[9]。近年来，日益增长的市场需求导致绿鳍马面鲀捕捞过度、自然资源量锐减。但随着人工繁育技术的突破及人工养殖技术的提高，绿鳍马面鲀已成为极具开发潜力且值得推广的优良养殖品种。
为开展绿鳍马面鲀自然资源的增殖放流、推动绿鳍马面鲀养殖产业的可持续发展，近年来对其苗种繁育和人工养殖技术的研究日渐增多。目前已对绿鳍马面鲀工厂化早繁苗种培育技术[10]及其早期生长发育与摄食特性[11]开展了研究。绿鳍马面鲀亲鱼自然繁殖期较晚(山东沿海大概在5—6月)，而北方沿海受冬季低温影响期较长，常温条件下培育亲鱼所获的鱼苗在当年达到商品规格的难度较大，因此可通过升温手段对亲鱼进行生殖调控，延长其养殖生长期，则有望实现当年养成商品鱼(体质量大于200 g)的目标。
目前，国内有关绿鳍马面鲀繁殖生物学的研究主要集中于亲鱼性成熟规格[12]、CYP17-Ⅰ基因克隆[13]及其生长周期中性类固醇激素受体的表达[14]等，关于其生殖调控期性腺发育的研究尚未见报道。此外，绿鳍马面鲀基于体表第二性征的性别二态性不明显[15]，难以通过鱼体形态等外部特征来准确判别雌雄及性腺的发育阶段。因此，本实验以绿鳍马面鲀亲鱼为研究对象，在早繁生殖调控期间，通过测量性腺生长指数，收集精巢和卵巢，观察性腺外部形态特征和组织学切片，阐明绿鳍马面鲀性腺发育的结构特征及其在繁殖周期的变化规律，以期进一步丰富绿鳍马面鲀繁殖生物学的基础资料，为其人工繁育和资源状况评估提供科学依据。
1.1 试验材料
试验所用绿鳍马面鲀亲鱼取自山东烟台普胜水产有限公司，年龄约3～5龄。将绿鳍马面鲀亲鱼饲养在水泥池中，为开放式流水养殖，盐度为29～33，pH为 7.8～8.3，溶解氧在5 mg/L以上，保持24 h增氧，试验期间记录水温的变化。亲鱼每天早晚各投喂一次，所用饵料为冷冻扇贝边、牡蛎、玉筋鱼或小虾。从2021年11月至2022年3月，每隔20天采集一次，每次采集雌、雄绿鳍马面鲀亲鱼各3尾，期间共采集5次，共计30尾；
试验观察至2022年5月。
1.2 试验方法
采用麻醉剂MS-222将绿鳍马面鲀亲鱼麻醉，对其外部形态拍照观察，测量鱼体全长(Total length，TL)和体质量(Body weight，BW)，然后解剖取出肝脏和性腺并测定性腺重量(Gonadal weight，GW)和肝脏重量(Liver weight，LW)。对性腺进行拍照观察后，立即将其置于波恩试剂中固定24 h后，用70%乙醇置换固定至无色，再保存于70%乙醇中，用于组织学分析。性腺指数(Gonadosomatic index，GSI)和肝胰腺指数(Hepatopancreas index，HSI)的计算公式如下：
GSI=GW/BW×100%
(1)
HSI=LW/BW×100%
(2)
将固定好的性腺样品按80%、85%、90%、95%和100%乙醇浓度梯度进行逐级脱水处理。用二甲苯对样品进行透明，然后石蜡包埋并进行连续切片，厚度约5 μm。之后用二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，苏木精-伊红染色，中性树胶封片，置于Olympus CX32型光学显微镜下拍照观察。
1.3 数据处理
2.1 绿鳍马面鲀亲鱼培育池水温的变化
自2021年11月中旬开始，对绿鳍马面鲀亲鱼进行人工驯养和越冬培育，主要通过控制水温和饵料营养强化等技术进行促熟，培育水温变化如图1所示。于11月15日开始将水温逐渐从15 °C降至12～13 °C，持续11 d，直至11月26日，然后将温度升至13～15 °C进行越冬。1月20日开始升温至17 °C进行促熟，使绿鳍马面鲀亲鱼自然产卵受精。试验期间，培育池水温的变化范围为12.7～21.5 °C。绿鳍马面鲀亲鱼在2月上旬水温16.5 °C时开始少量产卵，到2月中旬水温18.5 °C时产卵量稍多，到2月下旬水温21 °C时大量产卵。3月上旬水温降至17.0 °C，至5月上旬，绿鳍马面鲀亲鱼产卵结束。
2.2 绿鳍马面鲀亲鱼生长指标的变化
如表1所示，采样期间绿鳍马面鲀雌、雄亲鱼的体长、体质量、肝胰腺重量以及肝胰腺指数变化均无显著性差异(P>0.05)。但绿鳍马面鲀雌鱼性腺重量和性腺指数均在2月时达到最大，且显著高于其他月份(P<0.05)，雄鱼性腺重量和性腺指数也均在2月时达到最大，且显著高于11月、12月和1月采样时间段(P<0.05)。
表1 绿鳍马面鲀亲鱼生长指标的变化Tab.1 Changes in the growth index of the parental T.modestus
2.3 绿鳍马面鲀性腺发育的分期
2.3.1 绿鳍马面鲀卵巢中生殖细胞发育的过程及特点
绿鳍马面鲀卵巢发育以卵巢中卵母细胞最发达的阶段作为生殖腺的发育阶段，参照刘筠[16]对鲤科鱼类研究的分期标准对性腺发育进行分期，将早繁生殖调控期间绿鳍马面鲀的雌性生殖细胞发育分为6个时期(图2)。
注：A.核仁外周期(Pn)；
B.卵黄囊泡期(Yv)；
C.初级卵黄球期(Py)；
D.次级卵黄球期(Sy)；
E.三级卵黄球期(Ty)；
F.成熟期(Ri)。Notes：A.Perinucleolus (Pn)；
B. Yolk vesicle (Yv)；
C. Primary yolk (Py)；
D. Secondary yolk (Sy)；
E.Teritary yolk stage (Ty)；
F.Ripe (Ri).
1)第Ⅱ时相早期卵母细胞(图2A)：核仁外周期，11月绿鳍马面鲀卵巢发育处于此阶段，为初级卵母细胞小生长期，细胞呈多角形的圆形。细胞体积小，细胞直径为(99.54±10.01)μm；
细胞质较多，呈强嗜碱性；
细胞核呈微嗜酸性，核直径为(54.78±5.41)μm，核膜清晰可见，有分布在核的中央或边缘的核仁9～15个。细胞质与细胞核之间出现透明的环核圈，圈中含有少量的物质，细胞质中有少量的透明液泡，液泡在细胞质中环绕，数量不断增多。细胞质被苏木精染色深，核呈现巨大化，核中出现很多小的核仁。
2)第Ⅱ时相晚期卵母细胞(图2B)：卵黄囊泡期，12月绿鳍马面鲀卵巢发育处于此阶段，为小生长期，细胞体积明显增大，细胞直径为(115.17±10.81)μm。细胞质呈嗜碱性，但与第Ⅱ时相早期卵母细胞相比减弱；
细胞核直径为(55.69±5.21)μm，核质呈嗜酸性，核仁呈嗜碱性，有核仁9～20个。胞质外出现两层滤泡膜，其中有一层嗜酸性的放射带，细胞质中的滤泡有1～2层。
3)第Ⅲ时相早期卵母细胞(图2C)：初级卵黄球期，此时相是初级卵母细胞由小生长期阶段转到大生长期阶段的过渡时期。1月绿鳍马面鲀处于此阶段，细胞直径为(159.57±8.51)μm，细胞核体积变大，核直径为(70.86±3.00)μm，有分布在核边缘的核仁10～18个。液泡不断增多，由一层发展成两层甚至充满整个细胞质，卵径大小悬殊。
4)第Ⅲ时相中期卵母细胞(图2D)：次级卵黄球期，2月初绿鳍马面鲀卵巢发育处于此阶段，为大生长期，细胞体积不断增大，卵黄颗粒不断增加，最后几乎充满整个核外空间。细胞体积进一步增大，细胞直径为(210.25±13.31)μm，细胞质呈嗜碱性，胞质外出现的两层滤泡膜变得更加清晰，放射带明显增厚，核直径为(80.05±6.85)μm，核质呈嗜酸性，有核仁11～19个，胞质内出现被染为紫红色的卵黄颗粒并逐渐增多，由细胞质边缘向内细胞中央不断积累，但仍夹杂少量液泡。
5)第Ⅲ时相后期卵母细胞(图2E)：三级卵黄球期，2月底绿鳍马面鲀卵巢发育处于此阶段，细胞直径为(361.5±16.13)μm，卵黄颗粒逐渐融合形成粗大的卵黄板；
油滴融合形成油球。
6)第Ⅳ时相卵母细胞(图2F)：此时相是初级卵母细胞发育的晚期，是卵黄颗粒逐渐充满的时期，也是卵母细胞达到生长成熟的时期。3月绿鳍马面鲀卵巢发育处于此阶段，细胞体积增大，细胞直径为(292.25±18.39)μm，卵黄颗粒充满整个胞质，细胞核直径为(89.5±7.70)μm，核膜开始溶解，核仁开始向外排出。
2.3.2 绿鳍马面鲀精巢中生殖细胞发育的过程及特点
根据精巢组织学切片上大部分生殖细胞所处的阶段，并结合李霞[17]对精巢发育的分期，将绿鳍马面鲀的雄性生殖细胞发育分为5个时期(图3)。
注：a.精原细胞(Sg)；
b.初级精母细胞(Ps)；
c.次级精母细胞(Ss)；
d.精子细胞(St)；
e.精子(Sz)。Notes：a.Spermatogonium (Sg)；
b. Primary spermatocyte (Ps)；
c.Secondary spermatocyte (Ss)；
d.Spermatid (St)；
e.Spermatozoon (Sz).
1)第Ⅰ时相(图3a)：精原细胞，11月绿鳍马面鲀精巢发育处于此阶段。细胞呈圆形，体积较大。细胞质为弱嗜碱性或嫌色性(即对染料无明显的亲和力)；
细胞核一般比较大，呈嗜碱性，位于细胞中央。
2)第Ⅱ时相(图3b)：初级精母细胞，12月绿鳍马面鲀精巢发育处于此阶段。由精原细胞转化而成，细胞呈圆形或椭圆形，直径比精原细胞小。细胞质为嫌色性，染色质丰富，因此其染色比精原细胞深，没有明显的核仁，核直径为(2.29±0.43)μm。
3)第Ⅲ时相(图3c)：次级精母细胞，1月绿鳍马面鲀精巢发育处于此阶段。由初级精母细胞经第一次成熟分裂而形成。细胞呈圆形，体积较小，细胞质很少，为嫌色性。细胞核的嗜碱性比上一阶段增强，核直径为(1.73±0.21)μm。
4)第Ⅳ时相(图3d)：精子细胞，2月绿鳍马面鲀精巢发育处于此阶段。由次级精母细胞分裂而成，细胞体积小，无明显的细胞质，只含有强嗜碱性的圆形细胞核，核直径为(1.54±0.23)μm。
5)第Ⅴ时相(图3e)：精子，3月绿鳍马面鲀精巢发育处于此阶段。由精子细胞发育而成，细胞呈圆形，细胞体积最小，细胞核的嗜碱性最强，核直径为(1.14±0.13)μm，由头、颈、尾三部分组成。
3.1 人工繁殖绿鳍马面鲀亲鱼性腺发育成熟的时间
国内外对绿鳍马面鲀产卵期的时间均有相关报道，如许学龙[18]报道日本新潟沿海马面鲀的产卵期是5月下旬到7月上旬，备后滩的为5月下旬到6月下旬，太平洋西南海域的则在3月下旬开始产卵；
陈莲芳等[19]通过对东海绿鳍马面鲀产卵场和产卵期的调查，表明绿鳍马面鲀的产卵期是4月中旬到5月中旬，产卵盛期是4月中下旬，产卵场是钓鱼岛渔场；
张家男[20]对渤海区绿鳍马面鲀产卵期进行研究，表明绿鳍马面鲀的产卵期是5月下旬到7月上旬。本研究中，在人工生殖调控条件下，绿鳍马面鲀亲鱼的精巢和卵巢大部分在2月底达到成熟，且于2月底开始产卵，较自然海区提前了近2～3个月。研究表明，环境中的水温、光周期和光照强度对鱼类性腺发育成熟有重要的影响[21-23]，如综合运用水温和光照调节能有效诱导五条鰤(Seriolaquinqueradiata)[24]和赤点石斑鱼(Epinephelusakaara)[25]性腺的发育成熟；
在 14 °C水温条件下，大西洋鲑(Salmosalar)的成熟率显著高于其他温度条件[26]；
此外，水温提高至16～24 °C能够加强水流对草鱼(Ctenopharyngodonidellus)的刺激影响，从而促进其性腺的发育成熟[27]。本实验结果与上述结论基本一致，在人工生殖调控期间，水温调节有效地加快了绿鳍马面鲀的新陈代谢，刺激了性腺，从而促进其提前发育成熟。
3.2 繁殖前后绿鳍马面鲀卵子和精子的发生规律
目前对鱼类性腺发育的规律和分期，在国际上尚无统一标准。本研究所采用的分期方法以卵母细胞的内含物及其演变状态为依据，参照《中国养殖鱼类繁殖生理学》[16]对鲤科鱼类研究的分期标准对绿鳍马面鲀卵巢发育的时相进行分期，卵巢的发育分期以出现的最高时相卵母细胞为准，该方法结合生理学和细胞形态学理论进行分期划分，为国内大部分学者认同。
此外，按照卵母细胞的发育情况，硬骨鱼类的卵巢可以分为三种类型：1)完全同步型，卵巢内所有卵母细胞处在同一发育阶段，一生只产卵一次，产后便死亡，如大西洋鲑[28]；
2)分批同步型，卵巢内至少含有两种不同发育阶段的卵母细胞，每年通常成熟产卵一次，繁殖季节很短，如军曹鱼(Rachycentroncanadum)[29]和虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[30]；
3)分批非同步型，卵巢内含有各个阶段的卵母细胞，一年内可以多次产卵，繁殖周期长，如半滑舌鳎(Oplegnathuspunctatus)[31]和青鳉(Oryziaslatipes)[32]。通过对卵母细胞的组织学观察，结果表明绿鳍马面鲀的卵巢在不同发育时期含有不同时相的卵母细胞，且即使在同一发育期，仍有其他不同时相的卵母细胞，如在成熟卵巢中，次级卵黄球卵母细胞占比最高，此外还含有少量的未成熟卵母细胞，表明绿鳍马面鲀产卵类型为非同步发育分批产卵型。本研究结果为绿鳍马面鲀雌鱼分批次产卵生殖调控提供了科学依据。
硬骨鱼类精巢悬系于鳔的腹面、腹腔两侧的腹腔系膜上，一般成对出现[33]。关于精巢组织结构，也有多种标准，目前国内学者普遍采用Nagahama Y等[34]和Billard R[35]的观点，根据生精细胞的排列方式，将精巢结构分为小管型和小叶型。已有研究表明，绿鳍马面鲀[36]、黄鳝(Monopterusalbus)[37]、鲶(Silurusasotus)[38]等的精巢为典型的小叶型结构。与其他脊椎动物一样，鱼类精子的发生是在精巢中经过生殖、生长、成熟和变态几个连续时期中进行。与其他鱼类[39-41]相比，本研究在同一发育阶段的绿鳍马面鲀雄性生殖细胞虽然在外形和大小等方面略有差别，但基本结构是一致的。本研究结果中，绿鳍马面鲀精巢发育的分期及其成熟时间的确定为雄鱼的生殖调控提供了理论依据。
综上所述，在人工早繁生殖调控期间，通过对水温的调控，绿鳍马面鲀雌、雄亲鱼在2月均能达到完全成熟阶段，且在2月即开始产卵，较自然海区提前了2～3个月；
雌性生殖细胞(卵巢)的发育为核仁外周期、卵黄囊泡期、初级卵黄球期、次级卵黄球期、三级卵黄球期和成熟期6个时期，雄性生殖细胞(精巢)的发育则分为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子5个时期。本研究结果可为今后绿鳍马面鲀人工繁殖及其苗种生产提供科学依据。
