李双 宋欣颖 刘春艳 李冰
［摘要］ 目的
探讨Bcl-2相关抗凋亡基因3（BAG3）对非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）细胞增殖和迁移能力的影响。
方法 通过查询并整理TCGA数据库，对不同肿瘤中的BAG3表达进行泛癌分析。通过蛋白免疫印迹实验检测NSCLC细胞系（H1299、A549、H460、Anip973、PC9、H358和95-D细胞）以及人正常肺上皮细胞系Beas-2B中BAG3蛋白的相对表达量。H1299细胞分别转染Flag（A组）、Flag-BAG3质粒（B组），A549细胞分别转染siControl（C组）和siBAG3（D组）。通过蛋白免疫印迹实验检测质粒和小干扰RNA转染效率；
采用CCK-8和平板克隆实验检测BAG3对NSCLC细胞增殖能力的影响；
采用细胞划痕和Transwell实验检测BAG3对NSCLC细胞迁移能力的影响。
结果 BAG3 mRNA在6种肿瘤中的表达均高于正常组织（t=8.45～24.13，P<0.05）。各NSCLC细胞系中BAG3的表达水平均明显高于Beas-2B细胞（t=5.76～15.34，P<0.05）。相比于A组，B组细胞中BAG3蛋白的表达水平显著升高（t=6.01，P<0.05）；
相比于C组，D组细胞中BAG3的蛋白水平明显降低（t=4.59，P<0.05）；
相比于A组，B组细胞增殖和迁移能力明显增强（t=5.12～17.10，P<0.05）；
相比于C组，D组细胞增殖和迁移能力明显下降（t=6.26～14.13，P<0.05）。
结论 BAG3在NSCLC组织和细胞中高表达，并可促进NSCLC细胞的增殖和迁移。
［关键词］ 癌，非小细胞肺；
凋亡调节蛋白质类；
细胞增殖；
细胞运动
［中图分类号］ R747.2 ［文献标志码］ A
研究显示，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），作为肺癌的主要类型，其发病率占肺癌患者的80%～85%[1]。大多数NSCLC患者在确诊时已处于晚期，手术与放疗效果不佳，化疗成为其重要的治疗手段[2-3]，由于NSCLC患者的死亡率高，预后差，非常需要探索新的、更有效的治疗方法。
NSCLC发生的基础是细胞过度增殖和细胞凋亡抑制[4]。Bcl-2相关抗凋亡基因3（BAG3）蛋白是一种分子伴侣蛋白，在细胞应激、凋亡调控及信号转导等多个生物学过程中扮演着不可或缺的角色，其功能的多样性使BAG3在细胞生存与死亡的平衡中发挥着至关重要的作用[5-6]。BAG3作为一种分泌蛋白，能够通过肿瘤微环境促进肿瘤生长[7-8]。BAG3在乳腺癌、卵巢癌或胰腺癌等多种人类肿瘤组织中表达上调[9–11]。然而，BAG3在NSCLC细胞中的表达水平及其在NSCLC发生发展中的作用还不明确。本研究通过分析BAG3蛋白在NSCLC细胞中的相对表达水平，同时选取H1299和A549细胞对BAG3进行过表达和敲降处理，探究BAG3在NSCLC细胞增殖与迁移中的作用及其机制，旨在为NSCLC患者的临床靶向治疗提供新的靶点，以提高患者的治疗效果。
1 材料与方法
1.1 实验材料
人正常肺上皮细胞系Beas-2B、NSCLC细胞系H460细胞及95-D细胞由山东大学生物化学与分子生物学系实验室提供，NSCLC细胞系H1299、Anip973、PC9购买于上海吉凯生物技术有限公司，NSCLC细胞系A549和H358细胞由青岛大学病理学系实验室提供。过表达质粒Flag-BAG3及其空载体购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司，干扰BAG3的siRNA及其对照购自上海吉玛制药技术有限公司。Lipofectamine 2000购买于美国Invitrogen公司，细胞总蛋白提取试剂（RIPA）购自上海碧云天生物技术有限公司，BAG3抗体、GAPDH抗体购自英国Abcam公司，二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，PVDF膜购自德国默克密理博公司，ECL显色试剂盒购自美国GlpBio公司，Transwell小室购自美国Corning公司。
1.2 研究方法
1.2.1 BAG3基因的泛癌分析 在TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov）中下载33种肿瘤的RNAseq数据，再转换成TPM格式，使用R包中的ggplot2[3.3.6]、stats[4.2.1]、car[3.1-0]对数据进行统计分析，通过绘制箱线图分析BAG3基因在各种肿瘤组织中的相对表达量。
1.2.2 细胞培养 将Beas-2B细胞以及H1299、A549、H460、Anip973、PC9、H358和95-D细胞分别接种于含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中，随后在温度37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱内进行培养。当细胞生长密度达到80%～90%时，用于后续实验。
1.2.3 细胞转染 将H1299细胞分为A、B组，A549细胞分为C、D组，分别接种于6孔板中，按照上述方法进行培养。当H1299细胞密度达80%～90%时，A549细胞密度达50%～60%时，将原培养基替换为无血清且不含有抗生素的培养基，接着加入预先配置好的转染混合体系（由质粒或者小干扰RNA、Lipofectamine 2000、Opti-MEM配制而成），H1299细胞分别转染Flag（A组）、Flag-BAG3质粒（B组），A549细胞分别转染siControl（C组）以及siBAG3（D组），继续培养6 h，然后更换原培养基为富含血清并添加双抗的培养基。
1.2.4 Western blot实验检测细胞中BAG3蛋白表达水平 取生长密度约达90%的H1299、A549、H460、Anip973、PC9、H358、95-D、Beas-2B细胞，以及转染后的A～D组细胞，分别加入蛋白酶抑制剂和蛋白质裂解液RIPA的混合液裂解细胞，提取细胞总蛋白。利用Bradford方法测定蛋白的浓度，加入5×蛋白上样缓冲液后高温变性处理6 min，蛋白样品在10% SDS-PAGE凝胶上分离以后，转移到0.45 μm的PVDF膜上。在含有5%脱脂奶粉的TBST中封闭1 h后，将膜置于对应的一抗中，4 ℃下冰箱孵育过夜。加入与一抗匹配的二抗，室温震荡1 h，使用ECL化学发光试剂盒鉴定免疫反应条带。使用Image J软件分析条带的灰度值，目标蛋白的相对表达量=蛋白显色的灰度值/内参蛋白的灰度值。实验重复3次，结果取均值。
1.2.5 CCK-8实验检测细胞活力率 取转染后的A～D组细胞，经胰酶消化后，使用细胞计数法对细胞进行计数后，按照每孔2 000个细胞接种至96孔板中，每组设置5个复孔，置于培养箱中培养。在A、B组细胞分别于培养第48、72小时时，C、D组细胞分别于培养第72、96小时时，每孔加入CCK-8试剂10 μL，轻轻混匀，继续培养1～2 h。后使用酶标仪检测450 nm波长处各孔吸光度（A）值，计算细胞活力率。细胞活力率=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%，其中As=实验孔（含有细胞、培养基、CCK-8和待测物）的吸光度值，Ab=空白孔（含有培养基和CCK-8）吸光度值，Ac=对照孔（含有细胞、培养基和CCK-8）的吸光度值。
1.2.6 平板克隆实验检测细胞增殖能力 取转染后的A～D组细胞，通过胰酶消化并将细胞完全悬浮于完全培养基中，然后用细胞计数法将每孔约1 000个细胞接种到6孔板中。将6孔板置于细胞培养箱中培养约10 d，期间每3 d更换一次培养基并观察细胞状态，当多数单克隆细胞中的细胞数量超过50个时，用甲醇固定孔内细胞15～20 min，然后去除固定液，加入0.1%结晶紫染色2 h，最后用PBS洗涤平板并进行拍照，使用Image J软件对细胞克隆形成进行计数。
1.2.7 细胞划痕和Transwell实验检测NSCLC细胞系的迁移能力 取转染后的A～D组细胞，用胰蛋白酶消化细胞并重悬于完全培养基中，吹打均匀，然后按照适当的细胞密度接种到6孔板中，第2天，当细胞密度达到约90%时进行划痕。用200 μL的无菌枪头沿着直尺垂直在6孔板底部划出每孔大致相同宽度的划痕，然后用PBS轻轻洗涤孔里细胞，加入2 mL培养基继续培养细胞，在划痕后的第0、24、48小时观察细胞并用显微镜拍照。使用Image J软件计算细胞划痕面积，并计算细胞迁移率。细胞迁移率=（初始划痕面积-最终划痕面积）/初始划痕面积×100%。实验重复3次，结果取均值。
取转染后的A～D组细胞在无血清培养基中饥饿12 h。胰蛋白酶消化细胞后，重新悬浮细胞，密度调整为1×104/mL。在小室中加入100 μL无血清培养基置于细胞培养箱培养1 h后，在下室和上室分别加入700 μL含20%胎牛血清的培养基和200 μL的细胞悬液。置于细胞培养箱培养48 h，用PBS清洗小室后在孔中加入甲醇溶液进行固定，然后加入0.1%的结晶紫染色0.5 h，用PBS洗涤小室3次后，在普通倒置显微镜下观察迁移细胞，评估细胞迁移行为的变化，使用Image J软件计数细胞。实验重复3次，结果取均值。
2 结 果
2.1 BAG3基因的泛癌分析
在TCGA数据库对BAG3 mRNA在33种肿瘤中的表达水平进行分析，结果显示，与正常组织相比，BAG3在12种肿瘤组织中的表达差异有显著性，其中在非小细胞肺癌、结直肠癌、肝细胞肝癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、甲状腺癌的肿瘤组织中BAG3显著高表达（t=8.45～24.13，P<0.05），在肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、膀胱尿路上皮癌、肾嫌色细胞癌、子宫内膜癌以及前列腺癌组织中BAG3显著低表达（t=6.98～18.86，P<0.05）。
2.2 人正常肺上皮细胞及NSCLC细胞系中BAG3蛋白相对表达量比较
Western Blot实验结果显示，人正常肺上皮细胞Beas-2B及NSCLC细胞系H1299、A549、H460、Anip973、PC9、H358和95-D细胞中BAG3蛋白的相对表达量分别为0.27±0.01、0.84±0.05、1.23±0.04、0.32±0.03、0.72±0.01、0.51±0.02、0.64±0.01、1.09±0.03，其中NSCLC细胞系各细胞当中BAG3蛋白的相对表达量均显著高于Beas-2B细胞（t=5.76～15.34，P<0.05）。
见图1。
2.3 A～D组细胞中BAG3蛋白相对表达量比较
Western blot实验检测结果显示，A、B组细胞中BAG3蛋白相对表达量分别为0.56±0.05以及1.37±0.02，B组显著高于A组（t=6.01，P<0.05）；
C组、D组细胞中BAG3蛋白的相对表达量分别为0.98±0.03、0.35±0.02，D组显著低于C组（t=4.59，P<0.05）。见图2。
2.4 A～D组细胞中NSCLC细胞增殖能力的比较
CCK-8实验表明，A、B组细胞培养第48小时时细胞活力率分别为（100.0±0.8）%、（180.7±10.2）%，两组比较差异具有显著性（t=13.65，P<0.05）；
培养第72小时时两组细胞活力率分别为（100.0±1.7）%、（122.9±1.5）%，两组比较差异具有显著性（t=17.10，P<0.05）。C、D组细胞培养至第72小时时细胞活力率分别为（110.3±14.1）%、（40.8±1.6）%，两组比较差异具有显著性（t=8.47，P<0.05）；
C、D组培养第96小时时后细胞活力率分别为（100.0±4.9）%、（48.7±3.9）%，两组比较差异具有显著性（t=14.13，P<0.05）。
平板克隆实验结果显示，A、B组细胞的克隆形成数目则分别为（180.3±14.5）、（288.0±19.3）个，两组比较差异具有显著性（t=7.72，P<0.05）；
C、D组细胞的克隆形成数目则分别为（360.7±48.4）、（152.3±10.8）个，两组比较差异具有显著意义（t=6.26，P<0.05）。见图3。
2.5 A～D组细胞中NSCLC细胞迁移率的比较
细胞划痕实验结果显示，A、B组细胞培养第24小时时迁移率分别为（27.17±4.15）%、（45.20±4.50）%，两组比较差异具有显著性（t=5.12，P<0.05）；
培养第48小时时迁移率分别为（39.39±1.40）%、（70.37±3.49）%，两组比较差异有显著性（t=14.27，P<0.05）。C、D组细胞培养至第24小时时的迁移率分别为（24.34±2.29）%、（9.22±2.46）%，两组比较差异具有显著性（t=7.79，P<0.05）；
培养第48小时时迁移率分别为（41.88±3.56）%、（22.64±1.23）%，两组比较差异有显著性（t=8.83，P<0.05）。见图4。
Tranwell实验结果显示，A组、B组细胞从小室上层穿过至下层的数目分别为（543.70±33.08）、（818.70±30.44）个，两组比较差异有显著性（t=10.60，P<0.05）；
C、D组细胞从小室上层穿至下层的数目分别为（905.70±77.68）、（425.50±46.51）个，两组相比较差异有显著性（t=6.78，P<0.05）。见图5。
3 讨 论
NSCLC是一种高度侵袭性的肿瘤，其发生和进展可能是由多个基因的过度表达/过度激活或突变/功能丧失所致[12-13]。基因突变会影响细胞增殖、程序性细胞死亡（细胞凋亡）和DNA修复等细胞正常功能，随着细胞损伤积累的越多，NSCLC的微环境会发生缺氧和低pH、低代谢产物水平情况，致肿瘤发生的风险增高[14]。由于NSCLC早期临床表现较为隐匿，高达75%的NSCLC患者在确诊时已进入晚期阶段。同时NSCLC患者在使用分子靶向治疗药物过程中具有耐药性，为NSCLC患者的治疗带来了挑战[15]。靶向治疗药物在癌症治疗中发挥着关键作用，它们通过精准作用于肿瘤特定的基因和蛋白质，实现对肿瘤生长和扩散的有效抑制或阻断，进而达到治疗的目的[16]。NSCLC的靶向治疗发展迅速，明确的分子靶标加快了药物上市的脚步。因此，进一步深入研究NSCLC发生发展的机制会促进NSCLC靶向治疗的进展。
BAG3是细胞存活的重要调节因子，具有抑制细胞凋亡的作用[17]。BAG3又是一个高度保守的基因，主要分布在细胞质中，同时BAG3作为BAG共伴侣家族拥有众多结构域，具有多种蛋白理化特性和生物学功能[18]。BAG3通过参与蛋白酶体和自噬蛋白降解途径，控制细胞内蛋白质的稳定性和生命过程[19]。研究发现，BAG3与多种疾病的发生发展密切相关[20]，对肿瘤的生长、迁移、侵袭具有促进作用，同时也会影响肿瘤细胞对化疗药物的耐药性[21-23]。如研究显示，BAG3可以通过调控蛋白的稳定性，促进卵巢癌干细胞对铂类药物的耐药[21]；
紫杉素与BAG3抑制剂联合使用可以使肝细胞癌细胞死亡，由此表明两者的联合使用在HCC中是一种潜在抗肿瘤策略[22]。此外，在肺癌中，BAG3被抑制表达时可以减轻肺癌患者对顺铂的耐药性[23]。但是，BAG3在NSCLC增殖和迁移中的作用尚不清楚。
本研究首先通过TCGA数据库进行BAG3的泛癌分析，结果显示，BAG3在非小细胞肺癌、结直肠癌、肝细胞肝癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、甲状腺癌的肿瘤组织中高表达，在肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、膀胱尿路上皮癌、肾嫌色细胞癌、子宫内膜癌肿瘤和前列腺癌组织中BAG3显著低表达。之后采用Western blot实验分析比较了BAG3在H1299、A549、H460、Anip973、PC9、H358、95-D这些NSCLC细胞系和人正常肺上皮细胞系Beas-2B细胞中的表达水平，结果显示这7种NSCLC细胞系的BAG3蛋白相对表达量显著高于人正常肺上皮细胞系Beas-2B细胞。在深入探究BAG3基因在NSCLC细胞中的具体作用机制时，本研究广泛参考了相关领域的文献，并基于本实验室的特定条件和资源，选取了A549细胞进行BAG3基因的敲降实验，选择了H1299细胞进行BAG3基因的过表达研究，采用Western blot实验以检测这两种细胞中BAG3蛋白的表达情况，结果显示，过表达BAG3基因使B组细胞中BAG3蛋白的表达显著升高，敲降BAG3基因使D组细胞中BAG3蛋白的表达显著降低。CCK-8和平板克隆实验结果显示，与对照组细胞相比，过表达BAG3后H1299细胞增长加速，敲降BAG3后A549细胞增长减缓，提示BAG3可促进NSCLC细胞增殖。细胞划痕和Transwell实验结果发现，与对照组细胞相比，过表达BAG3后H1299细胞迁移的数目增多，敲降BAG3以后A549细胞迁移的数目减少，提示BAG3可以促进NSCLC细胞迁移。由此可以推测，BAG3基因是NSCLC细胞的促癌基因之一，与NSCLC的发生发展密切相关。
综上所述，BAG3在NSCLC组织和细胞中高表达。过表达BAG3后H1299细胞增长加速，细胞的迁移能力也明显增强；
敲降BAG3后A549细胞增长减缓，其迁移能力也显著降低。上述实验结果提示BAG3可以促进NSCLC细胞增殖和迁移，为NSCLC的治疗提供了新的思路和方向。然而，关于BAG3促进NSCLC发生和发展的具体分子机制，尚需进一步的深入研究和探讨。
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