张翊华 孙龙根 白春娜 贺婷婷 韩厚玉 高利华 莫坚武
衰老（aging）是机体从构成物质、组织结构到生理功能随年龄增大出现衰退的过程。犬的生命周期只有13 ～15年，搜救犬、导盲犬、搜毒犬、搜爆犬、警犬、军犬等工作犬的训练科目众多、费时费力，因此训成犬的服役时间很短。延缓工作犬的衰老速度、适当延长其服役年限，已成为每个训犬人和用犬人的一致心愿，而且，宠物犬的衰老和延缓衰老问题也越来越受到重视。不仅如此，犬的衰老过程要比人类快7 倍左右，是研究人类衰老的良好模型。
遗憾的是到目前为止，仍然没有鉴定犬衰老程度的客观评价指标。机体衰老以应激能力下降为特征，热休克蛋白70（HSP70）是机体为应答高温或应激而产生的一种蛋白分子，其表达量随衰老而下降。衰老相关β-半乳糖苷酶（β-gal）在体内随年龄增长而积累；
抑癌蛋白（P53）作为转录因子参与细胞周期控制、DNA 修复、细胞凋亡和细胞应激反应，调节细胞衰老和机体衰老，其含量随着衰老而逐渐增多。因次，本研究拟以血清中HSP70、β-gal 和P53浓度变化作为客观评价犬衰老程度的初选指标。
犬间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）是一种可以来源于骨髓、脂肪、脐带和胎盘等多种组织的成体干细胞，具有低免疫原性、高度增殖能力、多向分化潜能和广阔的临床应用前景。理论上讲，MSCs 回输机体后，可修复损伤组织、替换衰老细胞，起到治疗疾病和延缓衰老的作用，但目前仍缺乏实践依据。本项目拟进行警犬MSCs 抗衰老效果研究；
以输细胞前后血清HSP70、β-gal 和P53 浓度变化水平为指标，客观评价警犬MSCs 抗衰老效果；
观察试验犬的工作状态、身体和精神状态变化，建立警犬衰老和MSCs 抗衰老评价体系；
为MSCs 在工作犬抗衰老、延长服役期限中的广泛应用奠定基础。
（一）材料
犬骨髓MSCs（BMSCs）和脂肪MSCs（AMSCs）均来自健康警犬，由天津某公司提供。试验犬由上海某公司提供，包括2 头服役警犬和26 头退役警犬，年龄8 ～12 岁。
（二）方法
1.筛选犬衰老客观评价指标
挑选4 岁、6 岁、8 岁、10 岁和12 岁警犬各4 头，各年龄组4 头警犬均包括2 头比格犬和2 头马里努阿犬；
采集并分离每头犬的血清样品，送北京清析技术研究院检测HSP70、β-gal 和P53 浓度；
统计分析犬血清HSP70、β-gal 和P53 浓度随年龄变化的趋势。
2.MSCs 抗衰老试验
采用健康警犬8 头，品种包括比格犬2 头、马里努阿犬2 头、拉布拉多犬2 头、德国牧羊犬（工作犬系）1头、史宾格犬1头；
分成BMSCs 静脉输注组和AMSCs 静脉输注组，每组4 头。对每头犬进行连续3 次输细胞，剂量为1×105/kg 体重，每次间隔1个月，在输细胞前进行血常规和血液生化指标检验、评价健康状况，并在输细胞前和输细胞后1 个月采集血样，检测HSP70、β-gal和P53 浓度。此外，对各组犬在试验前和每次输细胞1月后进行录像，比较和观察其精神状态和体况表现。
（一）犬衰老评价指标筛选结果
1.4 岁、6 岁、8 岁、10 岁和12 岁警犬血清HSP70 浓度测定结果见图1（n=4）。从图可看出，犬除从4 岁到6 岁血清HSP70 浓度升高外，从8岁到12 岁血清HSP70 浓度呈直线下降趋势，这与犬衰老变化趋势相吻合，因此HSP70 血清浓度变化水平可作为犬衰老评价指标。
图1 不同年龄犬血清HSP70 浓度变化
2.4 岁、6 岁、8 岁、10 岁和12岁警犬血清β-gal浓度测定结果见图2（n=4）。从图2 可看出，犬从4 岁开始直到12 岁血清β-gal 浓度呈逐渐上升趋势，这与犬衰老变化趋势相吻合，因此β-gal 血清浓度变化水平可作为犬衰老评价指标。
图2 不同年龄犬血清β-gal 浓度变化
3.4 岁、6 岁、8 岁、10 岁和12 岁警犬血清P53 浓度测定结果见图3（n=4）。从图3 可看出，P53 血清浓度在犬4 岁～12 岁之间会缓慢增加，与犬衰老变化趋势相吻合，因此P53 血清浓度变化水平可作为犬衰老评价指标。
图3 不同年龄犬血清P53 浓度变化
（二）犬MSCs 抗衰老试验结果
1.警犬输细胞前后血清HSP70 浓度检测结果
输细胞前和每次间隔1 个月连续3 次输细胞后，BMSCs 组4 头犬的血清HSP70 浓度检测结果见图4，AMSCs 组4 头犬的血清HSP70 浓度检测结果见图5。由图看出，输注干细胞后BMSCs 组和AMSCs 组每头犬血清HSP70 浓度的下降速度均得到有效抑制，表明BMSCs和AMSCs 均具有抗衰效果。并且由图5 可看出，间隔1个月连续3 次输注AMSCs 后，抗衰效果至少可延续2个月。
图4 输BMSCs 前后HSP70 浓度变化
图5 输AMSCs 前后HSP70 浓度变化
2.警犬输细胞前后血清β-gal 浓度检测结果
输细胞前和每次间隔1 个月连续3 次输细胞后，BMSCs 组4 头犬血清β-gal 浓度检测结果见图6，AMSCs 组4 头犬血清β-gal 浓度检测结果见图7。由图可看出，3 次输细胞后，BMSCs 组和AMSCs 组血清β-gal浓度均显著低于输细胞前，并且均具有下降趋势，表明BMSCs 和AMSCs 均有抗衰老效果，多次输注有叠加效应。此外，由图7 可看出，每次间隔1个月连续3 次输注AMSCs 后，抗衰效果至少可延续2 个月。
图6 输BMSCs 前后β-gal 浓度变化
图7 输AMSCs 前后β-gal浓度变化
3.警犬输细胞前后血清P53 浓度检测结果
输细胞前和每次间隔1 个月连续3 次输细胞后，BMSCs 组4 头犬血清P53 浓度检测结果见图8，AMSCs组4 头犬血清P53 浓度检测结果见图9。由图看出，连续3 次输细胞后，BMSCs 组和AMSCs 组血清P53 浓度上升势头均明显受到抑制，第2 次和第3 次输细胞后血清P53 浓度均低于第1 次，并且AMSCs 组的P53 浓度下降趋势比BMSCs 组明显，证明BMSCs 和AMSCs 均具有抗衰效果，AMSCs 比BMSCs 抗衰效果更好；
多次输细胞有叠加效果。此外由图9 看出，间隔1个月连续输注3 次AMSCs 后，抗衰效果至少可延续2 个月。
图8 输BMSCs 前后P53 浓度变化
图9 输AMSCs 前后P53 浓度变化
4.输细胞后警犬的服役情况和精神状态变化
2 头服役犬中，搜爆犬“艾莉”（史宾格犬），2015年10月19日生，海关巡查犬“多多”（拉布拉多犬），2015年5月25日生，输细胞后直到目前仍在服役，工作状态良好。
退役犬中，试验前已有12 岁的“米克斯”和“31”（马里努阿犬），输细胞后直到现在体况和精神状态良好，看不出衰老迹象。
（一）警犬衰老评价指标
衰老机体表现为正常生理功能的不可逆衰退，包括记忆力下降、反应迟钝、运动能力减弱、相关激素分泌减少等多种脏器退行性变化，以及老年斑、皮肤褶皱、头发稀疏变白等外在表现，是生长抑制和获得性躯体损伤的累积效应。衰老机体中几乎普遍存在的是组织结构的改变，不仅在微观和宏观层面均有明显表现，而且伴随着组织功能的损伤和对损伤的反应缺失。客观评价机体的衰老程度一直是科学研究的重要课题。西班牙奥维耶多大学的卡洛斯教授等（2023）提出了12 个衰老标志：基因组不稳定、端粒磨损、表观遗传改变、蛋白质平衡丧失、巨噬功能丧失、营养感知失调、线粒体功能障碍、细胞衰老、干细胞衰竭、细胞间通讯改变、慢性炎症和生态失调。最近，中国衰老标志物研究联合体（ABC）六十多个研究组联合撰写综述，定义了衰老标志物的6 个支柱，包括生理学特征、影像学特征、组织学特征、细胞改变、分子改变和体液分泌因子。并指出，生理行为特征、影像学特征和体液分泌因子可作为衰老标志物临床转换的3 个可用指标。似乎机体的每个系统、每个器官、每种组织细胞都有不同的衰老标志物。我们从临床实用考虑，初选了3 个具有不同代表性的体液分泌因子——HSP70、β-gal 和P53 作为检测对象，分析他们在4 岁、6 岁、8 岁、10 岁和12 岁警犬血清中的浓度变化规律。结果表明，HSP70、β-gal和P53 血清浓度变化规律均与犬衰老变化趋势相吻合，可作为犬衰老评价指标。
（二）警犬MSCs 抗衰效果评价
研究表明，机体衰老的根本原因是干细胞的衰老，随着年龄增加干细胞数量不断减少，不能及时修复或替换正常衰老死亡的体细胞，造成整个机体组织结构和器官功能损害。MSCs 作为兼具再生和免疫调节功能的干细胞类型，可通过直接分化的细胞替代和细胞赋能方式促进衰老组织的再生修复。中国科学院昆明动物研究所博士生曾敏等（2023）将犬脐带MSCs 静脉注射到老龄犬（平均9 岁）体内进行抗衰老研究。结果表明，MSCs 逆转了3 个关键的潜在年龄相关基因(PYCR1, CCRL2 和TOX)的表达水平，显著降低了炎症因子(IL-6、TNF-α)水平，有效地改善了老龄犬的心脏功能。我们选用8 ～12 岁健康警犬8头，以1×105/kg 体重的剂量，间隔1个月连续3 次静脉输注BMSCs（4 头）和AMSCs（4 头），对比输细胞前后每头犬血清HSP70、β-gal 和P53 浓度变化水平。结果表明，BMSCs 和AMSCs均可改变每头犬血清HSP70、β-gal 和P53 浓度的正常变化趋势，均具有抗衰老效果，而且AMSCs 比BMSCs 抗衰效果更好；
多次输细胞有叠加效果；
间隔1个月连续输注3 次AMSCs 后，抗衰效果至少可延续2 个月。此结果为MSCs 在警犬抗衰老和延长工作犬服役年限中的广泛应用提供了可靠证据。
此外，从我们的试验结果看出，犬在输细胞前后血清HSP70、β-gal 和P53 浓度变化水平、工作犬服役年限、老龄犬的体况和精神状态，可构成犬MSCs 抗衰老评价体系。
（一）HSP70、β-gal 和P53 均可作为犬衰老和MSCs 抗衰老评价指标。输细胞前后，犬血清HSP70、β-gal 和P53 浓度变化水平、工作犬服役年限、老龄犬的体况和精神状态，可构成犬MSCs 抗衰老评价体系。
（二）犬BMSCs 和AMSCs 均具有抗衰老效果，但AMSCs 比BMSCs 更好一些；
MSCs 多次输注有叠加效应；
每次间隔1个月以1×105/kg 剂量连续3次输注细胞后，抗衰效果至少可延续2个月。
