张子杰，田益玲，夏君霞，马爱进,*
（1.北京工商大学食品与健康学院，北京 100048；
2.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001；
3.河北养元智汇饮品股份有限公司，河北 衡水 053000）
核桃是一种广泛分布在世界各地的坚果，在全球范围内被商业化种植[1]，其主要成分包括脂肪和蛋白质[2]。在压榨核桃油的过程中，会产生大量的核桃粕，其中富含各种蛋白质[3]。核桃蛋白是一种优质的植物蛋白，可以满足成年人的基本氨基酸需求。然而，与核桃蛋白相比，核桃肽具有更好的溶解性、吸湿性、乳化性和胃肠消化的稳定性等优良特性[4-6]。此外，核桃多肽具有多种生物功能，在抗氧化、降血脂、抗肿瘤、改善记忆和降低患阿尔茨海默症风险以及改善肠道菌群等方面具有显著的效果[7-15]。
近年来，越来越多的研究致力于从植物蛋白中提取抗氧化活性肽[16]。植物抗氧化肽有诸多优势，如改善与氧化应激有关的疾病[17-18]。以往的研究表明，天然抗氧化剂可以减缓食品的氧化过程[19-20]，提高质量并延长保质期[21-22]。将植物蛋白作为天然抗氧化肽的来源进行探索和商业化，能够促进自然资源的可持续利用。核桃粕所富含的蛋白质资源显示出制备抗氧化肽的巨大潜力[23-24]。一些文献报道了核桃多肽的抗氧化活性，如郭勇等[25]测定了长白山核桃源五肽对氧化损伤细胞的保护作用。然而，目前关于核桃多肽抗氧化作用和结构表征的系统性研究报道较少。因此需要更多的研究以深入了解核桃多肽在抗氧化过程中的具体机制，并对其结构进行进一步的表征和分析。这将有助于揭示核桃多肽的结构特征与其抗氧化活性之间的关联，为其进一步应用于食品工业等领域提供科学依据。
本研究以核桃粕作为原料，通过复合酶酶解的方法制备核桃多肽，对其进行抗氧化性分析、结构表征，并通过细胞实验探索核桃多肽对氧化损伤HepG2细胞的保护作用。以期为核桃高值化利用提供理论依据。
1.1 材料与试剂
核桃粕 河北养元智汇饮品股份有限公司。
活性氧（reactive oxygen species，ROS）测定试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性测定试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性测定试剂盒、还原型谷胱甘肽酶（glutathione reductase，GSHRx）测定试剂盒、总谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）检测试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；
羟自由基清除能力检测试剂盒 苏州格锐思生物科技有限公司；
胰蛋白酶、碱性蛋白酶、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）美国Biotopped公司；
过硫酸钾 上海Aladdin公司。
1.2 仪器与设备
高速离心机 日本日立公司；
多功能酶标仪 瑞士Tecan公司；
冷冻干燥机 德国Christ公司；
精密pH计、电子分析天平 梅特勒托利多科技（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 ABTS阳离子自由基清除能力测定
将0.35 mL ABTS阳离子自由基溶液（7.4 mmol/L）与0.35 mL过硫酸钾溶液（2.6 mmol/L）混合，将其避光放置12～16 h，得到ABTS阳离子自由基工作液。用体积分数为95%的乙醇溶液稀释混合液（体积比约1∶35），测得734 nm波长处的吸光度为0.70±0.02。每个孔中加入160 μL的ABTS阳离子自由基工作液。在样品孔中加入40 μL不同质量浓度的样品溶液，轻轻混合，并在室温条件下避光环境孵育6 min。在734 nm波长处测量吸光度[26]。用无水乙醇替代样品作为空白组，用无水乙醇替代ABTS阳离子自由基工作溶液作为对照组，ABTS阳离子自由基清除率按式（1）计算：
式中：Ab为空白组的吸光度；
As为样品组的吸光度；
Ac为对照组的吸光度。
1.3.2 DPPH自由基清除能力的测定
将100 μL样品溶液和100 μL的0.1 mmol/L DPPH溶液（无水乙醇配制）加入到96 孔板中，混合均匀，在室温黑暗条件下孵育30 min后，测量517 nm波长处吸光度As；
用蒸馏水与DPPH溶液混合反应作为空白组，测量吸光度Ab；
无水乙醇代替DPPH溶液混合反应，测量吸光度Ac[27]。DPPH自由基清除率按式（2）计算：
1.3.3 羟自由基清除能力的测定
使用试剂盒测定羟自由基清除能力。根据说明书设置空白组、对照组和样品组，并依次加入试剂。在37 ℃条件下反应20 min，测量510 nm波长处吸光度。羟自由基清除率按式（3）计算：
式中：Ab为空白组的吸光度；
As为样品组的吸光度；
Ac为对照组的吸光度。
1.3.4 核桃多肽的制备
核桃粕蛋白提取采用碱提酸沉法，将脱脂核桃粕低温粉碎、过筛，与蒸馏水以一定比例混合，用1 mol/L NaOH溶液调pH值至8.6，碱溶1 h，8 000 r/min离心10 min，取上清液，调pH值至4.6，酸沉1 h，8 000 r/min离心，水洗3 次，调节pH值为7.0，冷冻干燥，得核桃蛋白。
核桃多肽制备方法参考文献[28]并略作修改。将100 g核桃蛋白加入1.9 L去离子水中，用磁力搅拌器充分搅拌。将pH值调至8.0，加入碱性蛋白酶400 000 U和胰蛋白酶200 000 U，并在50 ℃水解4 h。在4 ℃、8 000 r/min条件下离心15 min，取上清液，冻干。冻干后的核桃蛋白水解产物粉末在-20 ℃条件下保存。
1.3.5 核桃多肽的超滤分级
核桃蛋白水解产物溶液在超滤过程中通过3 个特定分子质量超滤膜。首先，核桃蛋白水解产物溶液经过截留分子质量为10 kDa的超滤膜，允许分子质量＜10 kDa的核桃蛋白水解产物通过。再使用截留分子质量为3 kDa的超滤膜进一步分离，最后使用截留分子质量为1 kDa的超滤膜，以获得不同分子质量的馏分。分别收集到＜1 kDa、1～3 kDa、3～10 kDa和＞10 kDa 4 个不同分子质量范围的核桃蛋白水解产物馏分。在真空下干燥，以获得这些特定分子质量范围内的核桃蛋白水解产物粉末。
1.3.6 扫描电镜观察
将干燥的核桃多肽样品用导电胶固定在样品座上，置于扫描电镜观察台，调节扫描电镜焦距至清晰，分别观察放大5 000 倍和1 000 倍的图像。
1.3.7 紫外全波长扫描
称取核桃多肽粉末溶于蒸馏水，使其终质量浓度为0.7 mg/mL。蒸馏水作为空白组，与多肽样品溶液分别在200～500 nm波长范围内进行紫外全波长扫描。
1.3.8 荧光光谱分析
测定核桃多肽组分的荧光光谱对其结构进行表征。称取核桃多肽粉末溶于蒸馏水，使其终质量浓度为0.2 mg/mL。激发波长为285 nm，激发和发射狭缝均为5 nm，研究核桃多肽样品在发射光谱300～400 nm波长范围的荧光光谱，扫描5 次。
1.3.9 圆二色光谱分析
使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）将样品溶解至质量浓度0.2 mg/mL。在波长190～260 nm范围测定圆二色光谱，步长1 nm。以PBS作为空白对照，空白对照与样品溶液上样量均为300 μL，测试后保存数据，计算样品二级结构。
1.3.10 HepG2细胞实验
HepG2细胞在由10%胎牛血清和90%高糖DMEM培养基组成的DMEM完全培养基中培养。在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养细胞，加入胰酶细胞消化液进行传代。将对数生长期的HepG2细胞在6 孔板或96 孔板上进行培养，用于进一步实验。
1.3.10.1 核桃多肽对HepG2细胞存活率的影响
取生长状态良好的HepG2细胞，消化细胞，轻轻吸打使细胞重悬。用血球计数板计算细胞浓度，之后将HepG2细胞接种到96 孔板中，密度为1×105个/mL，每孔100 μL。然后将培养板放在培养箱中培养1～2 d。在细胞面积达到70%～80%后，吸去原来的培养基。设置只加培养基的空白组、未经处理HepG2细胞的对照组以及在各孔中加入质量浓度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL核桃肽溶液的样品组，培养24 h。引入CCK-8溶液并进一步培养2 h。使用酶标仪测量各组在490 nm波长处的OD值。细胞存活率按式（4）计算：
1.3.10.2 H2O2对HepG2细胞存活率的影响
设置只加培养基的空白组、未经处理HepG2细胞的对照组以及在各孔中加入终浓度62.5、125、250、500、1 000 μmol/L H2O2溶液的模型组，培养4 h。引入CCK-8溶液并进一步培养2 h，按1.3.10.1节方法测定细胞存活率。
1.3.10.3 核桃多肽预处理对氧化损伤HepG2细胞存活率的影响
设置只加培养基的空白组、未经处理HepG2细胞的对照组、未经处理HepG2细胞的模型组以及在各孔中加入0.4、0.6、0.8 mg/mL核桃肽溶液的样品组，培养24 h。吸去原有培养基，在模型组及样品组中加入800 μmol/L H2O2溶液，培养4 h。引入CCK-8溶液并进一步培养2 h，按1.3.10.1节方法测定细胞存活率。
1.3.10.4 核桃多肽预处理对氧化损伤HepG2细胞内ROS含量的影响
细胞培养方法同上。设置只加培养基的空白组、未经处理的HepG2细胞对照组、未经处理的HepG2细胞模型组以及在各孔中加入终质量浓度0.4、0.6、0.8 mg/mL核桃肽溶液样品组，培养24 h。吸去原有培养基，在模型组及样品组中加入800 μmol/L H2O2溶液，培养4 h。根据ROS测定试剂盒说明书测定ROS含量。
1.3.10.5 核桃多肽预处理对氧化损伤HepG2细胞抗氧化酶活力的影响
参照1.3.10.4节设置空白组、对照组、模型组和样品组，消化细胞。通过加入DMEM完全培养基（1 mL），消化反应停止。将所得的细胞悬液移到离心管中离心，弃上清液后，重新悬浮细胞。在冰水浴中，使用300 W的细胞超声处理，制备均匀的细胞匀浆，超声30 s，重复4 次，每次间隔5 s。根据CAT活性测定试剂盒、SOD活性测定试剂盒、GSH-Rx活性测定试剂盒、总GSH-Px活性检测试剂盒的说明书，在合适的条件下进行测定。
1.4 数据处理与分析
每组数据进行3 次平行实验。采用SPSS 22.0软件进行数据处理。GraphPad Prism 9.0软件用于绘制图形。
2.1 核桃蛋白水解产物的抗氧化活性
如图1a所示，核桃蛋白水解产物的羟自由基清除率与0～30 mg/mL的质量浓度呈剂量依赖性，半抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）值为13.20 mg/mL。这表明此蛋白水解产物浓度对羟自由基具有明显的抑制作用。如图1b所示，核桃蛋白水解产物对DPPH自由基的清除率在0～200 μg/mL范围内呈剂量依赖性，IC50值为36.07 μg/mL。结果表明，核桃蛋白水解产物具有清除DPPH自由基的能力。如图1c所示，在0～150 μg/mL范围内，底物质量浓度与ABTS阳离子自由基清除率之间存在显著的剂量依赖关系。在底物质量浓度为100 μg/mL时，水解产物的ABTS阳离子自由基清除率为90.13%，IC50值为52.02 μg/mL。核桃蛋白的酶解可能导致肽的空间构象、氨基酸组成和分子排列的变化，从而提高清除ABTS阳离子自由基的能力。
图1 核桃蛋白水解产物对羟自由基（a）、DPPH自由基（b）以及ABTS阳离子自由基（c）清除率的影响Fig.1 Hydroxyl (a),DPPH (b) and ABTS radical cation (c) scavenging capacity of walnut protein hydrolysates
2.2 核桃多肽不同分子质量组分抗氧化活性
将超滤后得到不同分子质量的核桃多肽进行ABTS阳离子自由基清除能力比较，结果如图2所示。随着核桃多肽分子质量的逐渐减小，核桃多肽的ABTS阳离子自由基清除率呈现逐渐增大的趋势。其中分子质量＜1 kDa抗氧化肽组分的ABTS阳离子自由基清除率最高，为90.95%。结果表明，核桃多肽的ABTS阳离子自由基清除率与肽分子质量呈负相关。
图2 不同超滤组分对ABTS阳离子自由基清除率的影响Fig.2 ABTS radical cation scavenging capacity of different ultrafiltration fractions
2.3 核桃多肽＜1 kDa组分抗氧化活性
由图3a可知，＜1 kDa组分对羟自由基有较好的清除作用，在0～30 mg/mL范围内，核桃多肽组分的羟自由基清除率随质量浓度增大而增大，IC50值为11.47 mg/mL。核桃肽的特点是分子质量小，含有丰富的供氢体，可以通过提供氢质子有效减少高度氧化的自由基[29]。如图3b所示，在底物质量浓度0～600 μg/mL范围内，核桃多肽的DPPH自由基清除率随底物质量浓度增大而逐渐增大，IC50值为35.67 μg/mL。这可能归因于核桃蛋白被酶解后释放作为质子供体的特定物质，这些质子供体与DPPH自由基发生反应，将其转化为稳定的反磁性分子，从而显示出强大的抗氧化活性[30]。如图3c所示，在0～150 μg/mL范围内，核桃多肽的ABTS阳离子自由基清除率随底物质量浓度增大而增大，随后趋于稳定，在100 μg/mL时，其ABTS自由基清除率为90.45%，IC50值为49.72 μg/mL。核桃多肽表现出强大的清除ABTS阳离子自由基能力。尽管核桃多肽的抗氧化能力比VC弱，但这种天然的功能性活性物质可以安全地长期食用，并且没有表现出毒副作用。以上结果与李汉洋等[31]的研究结果一致。
图3 ＜1 kDa核桃多肽组分对羟自由基（a）、DPPH自由基（b）以及ABTS阳离子自由基（c）清除率的影响Fig.3 Hydroxyl radical (a),DPPH radical (b) and ABTS radical cation (c)scavenging capacity of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa
2.4 核桃多肽＜1 kDa组分的结构表征
2.4.1 微观结构观察
由图4可看出，核桃多肽形状不规则、表面光滑、结构致密，有大量粗糙纹路和孔隙，这种结构能够极大地增加核桃多肽的表面积。这可能是由于核桃蛋白质结构因蛋白酶酶解而被破坏，使得疏水性基团暴露在多肽表面，进而提高核桃多肽疏水性，提升抗氧化活性。分子质量、疏水性、氨基酸组成和肽序列被认为是影响肽抗氧化活性的关键结构特征[32]。有研究人员对具有抗氧化活性的植物来源肽与其疏水性作用的关系进行了综述，得出疏水性作用是多肽抗氧化活性的决定因素之一[33]。
图4 ＜1 kDa核桃多肽组分的微观结构Fig.4 Microstructure of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa
2.4.2 紫外全波长扫描分析
如图5所示，核桃多肽的最大吸收峰位于225 nm波长处，表明该波长范围产生价电子跃迁，最大吸收峰的吸光度为8.94。这可能是因为＜1 kDa核桃多肽在酶解过程中部分肽链被水解，使游离氨基酸含量提高以及多肽中生色团和助色团的偏光性而形成。
图5 核桃多肽＜1 kDa组分的的紫外全波长扫描Fig.5 Ultraviolet absorption spectrum of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa
2.4.3 荧光光谱扫描
有研究表明色氨酸（Trp）残基与最大发射波长（λmax）有关[34]，如图6所示，核桃多肽的λmax分布在345 nm处，当λmax＞330 nm时，这说明核桃多肽中的Trp残基主要暴露在多肽分子表面的极性环境中。同时，荧光强度与暴露在极性环境中Trp残基的数量呈正相关。Trp残基暴露在极性环境中的程度和数量能够反映核桃多肽的表面疏水性，这可能是核桃多肽具备抗氧化活性的原因之一。有研究表明，Trp、脯氨酸等疏水氨基酸在消除自由基中起着重要作用[35]。
图6 ＜1 kDa核桃多肽组分的的荧光光谱Fig.6 Fluorescence spectrum of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa
2.4.4 圆二色光谱分析
圆二色光谱可以表征核桃多肽的二级结构，结果如图7、表1所示。核桃多肽的二级结构包含多种构象，主要为β-折叠（相对含量为36.6%）和无规卷曲（相对含量为36.5%），其中反平行式β-折叠相对含量为33.7%，平行式β-折叠为2.9%。β-折叠及无规卷曲含量较高，α-螺旋结构（紧密的稳定结构）含量较低，这能够反映出多肽表面的疏水性增强。核桃多肽表现出一定的抗氧化能力，原因可能是蛋白质结构由于酶解而发生改变，肽键被蛋白酶切断，使其空间结构打开，这种结构变化意味着蛋白质分子内无序结构（β-折叠和无规卷曲）的含量变高，从而使疏水性位点暴露在多肽分子外部的极性环境中[36]。疏水性对多肽的抗氧化活性具有重要影响。当疏水性氨基酸残基暴露在多肽表面时，其有助于多肽在脂质-水界面处溶解，进而更有效地清除自由基，发挥抗氧化作用[37]。
表1 核桃多肽＜1 kDa组分的二级结构Table 1 Secondary structure composition of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa
图7 核桃多肽＜1 kDa组分的的圆二色光谱Fig.7 Circular dichroism spectrum of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa
2.5 ＜1 kDa核桃多肽组分及H2O2对HepG2细胞存活率的影响
为了确定后续实验中核桃多肽组分的作用浓度，通过CCK-8实验研究了不同浓度的核桃多肽组分对HepG2细胞存活率的影响，结果见图8a。与空白组相比，＜1 kDa核桃多肽组分的质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL时，对细胞存活率无影响。因此，选取0.4、0.6、0.8 mg/mL的＜1 kDa核桃多肽组分进行下一步实验。
图8 不同浓度＜1 kDa核桃多肽组分（a）及H2O2（b）对HepG2细胞存活率的影响Fig.8 Effects of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa (a) and H2O2 (b) on the survival rate of HepG2 cells
ROS的主要成分之一是H2O2，能够诱发氧化应激，破坏细胞的氧化还原平衡，在氧化应激条件下最终导致细胞程序性死亡或组织损伤。如图8b所示，经过不同浓度H2O2孵育4 h后，随着H2O2浓度的增加，细胞存活率持续降低，并呈现一定的浓度依赖性。当H2O2浓度为1 000 μmol/L时，细胞存活率仅为47.28%。经过计算，细胞的IC50为804.9 μmol/L，因而选择800 μmol/L作为后续实验的H2O2浓度。
2.6 ＜1 kDa核桃多肽组分对氧化损伤HepG2细胞存活率及ROS的影响
如图9a所示，与对照组相比，模型组的细胞存活率显著降低（P＜0.05），从而证实了实验模型成功建立。用不同质量浓度的核桃多肽样品培育24 h后，其细胞存活率呈浓度依赖性增加趋势，这表明核桃多肽可以减轻H2O2诱导的细胞损伤，并保护细胞存活。当核桃多肽质量浓度为0.8 mg/mL时，可以显著提高HepG2细胞的存活率（P＜0.05）。
图9 ＜1 kDa核桃多肽组分对氧化损伤HepG2细胞存活率（a）及ROS水平（b）的影响Fig.9 Effect of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa on the survival rate (a) and ROS level (b) of oxidatively damaged HepG2 cells
ROS的过度产生可能破坏细胞氧化还原系统的平衡，导致组织损伤。因此，本实验通过测定细胞内的ROS水平评估细胞内氧化损伤程度。如图9b所示，与对照组相比，模型组的ROS水平度显著增加（P＜0.05），表明实验模型有效建立。与模型组相比，0.8 mg/mL核桃多肽组的ROS水平显著减少（P＜0.05），为107.81。这与Liu Chunlei等[29]的研究结果一致，核桃多肽能够提高细胞存活率，减少细胞中ROS的生成。
2.7 ＜1 kDa核桃多肽组分对H2O2诱导HepG2细胞内抗氧化酶的影响
如图10a所示，模型组的SOD活性显著降低。然而，当用不同质量浓度的＜1 kDa核桃肽组分预处理HepG2细胞时，SOD活性呈明显的剂量依赖性增加，当质量浓度为0.8 mg/mL时，SOD活力为172.20 U/mg。由此表明，＜1 kDa核桃多肽组分能够提高HepG2细胞中SOD的活力水平，表明其具有增强细胞抗氧化活性的潜力。如图10b所示，与对照组相比，模型组的CAT活力下降；
与模型组相比，样品组的CAT活力均提高，并随着多肽组分浓度的增加而增加。由此表明，＜1 kDa核桃多肽组分能够提高HepG2细胞中CAT的活力水平。GSH-Px的主要功能是清除过氧化氢和脂类氢过氧化物，从而保持细胞的稳态。如图10c所示，与空白组相比，模型组的GSH-Px的活力水平显著下降；
与模型组相比，经＜1 kDa核桃多肽组分预处理样品组的GSH-Px的活力水平均提高，并随着多肽组分浓度提高而提高。氧化型谷胱甘肽能够被GSHRx还原成GSH，提供清除ROS所需的还原力，从而保护生物系统免受氧化损伤。如图10d所示，模型组的GSHRx的活力显著下降；
与模型组相比，样品组的GSH-Rx活力水平均提高，并随着多肽组分浓度提高而提高。上述结果与Zhao Fanrui等[38]的研究结果相似。
图10 ＜1 kDa核桃多肽组分对H2O2诱导HepG2细胞内抗氧化酶的影响Fig.10 Effect of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa on H2O2-induced antioxidant enzymes in HepG2 cells
本实验以核桃肽为研究对象，分析了超滤后不同分子质量核桃肽的抗氧化活性，发现分子质量＜1 kDa核桃多肽组分的抗氧化活性最强，其羟自由基清除能力的IC50值为11.47 mg/mL、DPPH自由基清除能力的IC50值为35.67 μg/mL、ABTS阳离子自由基清除能力的IC50值为49.72 μg/mL，均呈现出浓度依赖性。同时，＜1 kDa核桃多肽组分对H2O2引起的HepG2细胞氧化损伤具有一定的保护作用，能够减少HepG2细胞内ROS含量，提高HepG2细胞内抗氧化酶的活力水平。核桃多肽形状不规则、表面光滑、结构致密，有大量粗糙纹路和孔隙。核桃多肽的二级结构以多种构象并存，主要为β-折叠（相对含量为36.6%）和无规卷曲（相对含量为36.5%）。核桃多肽具有良好的抗氧化活性，可用于开发核桃肽功能食品，本研究对实现核桃粕的高值化利用有一定参考价值。
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