旷珊珊，张耀文，赵 娜，杨艺欣，解继胜
（右江民族医学院，广西 百色 533000）
绝经后骨质疏松症（PMOP）是一种常见但慢性的全身性代谢性疾病，严重影响女性的生活质量。随着全球预期寿命的延长，PMOP 已成为主要的公共卫生问题［1］。女性绝经期有其特殊的生理特点，例如，中医中的“天癸竭”症状与更年期女性雌激素合成和分泌逐步减少等所导致的机体变化相似，而更年期雌激素合成和分泌减少是导致 PMOP 的主要原因［2］，这一时期的妇女容易出现肾功能障碍和肝郁。“肝郁”是绝经后骨质疏松症发生的特殊机制。［3］，故 疏 肝 理 气 是PMOP 治 疗 中 必 须 重 视 的 环节。肝虚不藏血，筋弱不激骨，肝主筋司运动，骨痹的发病与肝脏关系密切。逍遥丸具有疏肝解郁疗效，然而逍遥丸治疗骨质疏松（osteoporosis，OP）的具体作用机制尚不明确。因此，在本研究中，为了给阐明OP 治疗的作用机制提供参考，利用网络药理学预测了OP 治疗的潜在靶点通路，根据预测结果着手于AGEs/RAGE 信号通路关键蛋白 rage、IL-6 的表达，以及成骨细胞早期特异性标志物碱性磷酸酶（ALP）和骨细胞外基质的主要成分COL-1观察 OP 对小鼠骨组织的治疗效果，并通过动物实验验证了预测结果。
1.1 实验动物
雌性C57BL /6 小鼠，年龄10～12 周、SPF 级、体重（22±2） g ，购自广东省维通利华有限公司（SCXK（粤）2022-0063），饲养于右江民族医学院SPF 级动物实验中心（许可证号：SYXK 桂2022-0004），实验动物的生长温度保持在24 ℃～26 ℃，相对湿度保持在55%～60%。实验过程严格遵守动物实验中心以及使用指南进行，研究方案获得了右江民族医学院实验动物伦理委员会的批准（批号：2022101502）。
1.2 实验试剂
75%酒精、戊巴比妥钠、生理盐水、逍遥丸（购自右江民族医学院附属医院）、4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司，批号：P1110）；
RAGE 抗体（稀释比例1∶300 Rabbit：
bs-4999R）、IL6 抗体（稀释比例1∶300 Rabbit：
bs-0782R）、COL-1 抗体（稀释比例1∶200 Rabbit：
bs-10423R）、ALP 抗体（稀释比例1∶200 Rabbit：
A0514）、免疫显色试剂（MaxVision-HRP 鼠/兔）（ KIT-5030 福州迈新生物技术开发有限公司）、Ultra DAB 显色试剂盒（ DAB-4033 福州迈新生物技术开发有限公司）、苏木精-伊红（ HE）染色试剂盒（G1120，索莱宝）；
荧光倒置显微镜（2015236500，Leica DMI3000B）。
1.3 网络药理学
通过参考近几年的文献资料，选择利用TCMSP 数据库［4］对“逍遥丸”药物成分及相关靶点进行了搜集与分析，筛选出口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18［4］的有效成分，搜集其相关靶标，而后，使用关键词“osteoporosis”在Gene-Cards 等数据库［5］中收集了“骨质疏松症”的疾病靶点，并通过删除重复靶点在 Unitprot 数据库中进行了归一化处理。然后，使用在线制图工具 Venny 2.1.0 生成韦恩图，以获得药物-疾病交叉靶点，使用生物信息学分析软件 Cytoscape 3.6.1［6］绘制活性成分、成分相关靶点和疾病相关靶点，构建活性成分-靶点网络，其中，“节点”分别代表成分、靶点，“边”代表节点之间的相互关系。最后利用DAVID数据库对药物-疾病交叉靶点进行了GO 及KEGG富集分析［6］，即基于不同的分类思想而储存的基因相关功能。而后，利用 imageGP 在线绘图软件绘制了气泡图，对前 20 个 GO 生物功能和前 30 个KEGG 信号通路富集结果进行可视化分析，并将富集结果按P值从低到高进行排序。
1.4 动物模型的建立
实验小鼠经7 d 适应性饲养后，随机分为4 组，分别为假手术组（Sham）、模型组（Ovx）、逍遥丸高浓度组及低浓度组。实验小鼠以3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，采用75%乙醇进行局部消毒，通过双侧卵巢摘除法给模型组与药物组小鼠造模，假手术组切除卵巢附近少量脂肪组织作为对照。术后对小鼠给予大庆霉素消毒3 d 预防感染。
1.5 给药方法
根据徐叔云主编《药理实验方法学》，进行人与动物剂量换算，逍遥丸以成人9 g 为1 剂的量，则小鼠中剂量为9 g/60 kg×9.1=1.365 g/kg，低剂量为0.683 g/kg，高剂 量为2.73 g/kg，每组8 只，每日1次，连续喂药12 周。假手术组和模型组每天接受一次生理盐水，生理盐水量根据动物体重而定，每日1次，持续12 周。
1.6 HE 染色
根据说明书操作，将卵巢样本进行染色并拍照观察；
小鼠股骨经EDTA 脱钙脱钙液处理1 月后，对小鼠股骨进行 HE 染色。
1.7 Micro CT
将不同组别小鼠的股骨标本周围的肌肉和韧带剔除，并在4%多聚甲醛中固定24 h，骨组织晾干后送右江民族医学院附属医院 Micro-CT 室进行骨组织扫描，以获得三维显微 CT 数据。
1.8 免疫组化
将保存的小鼠蜡块进行6 μm 厚连续性切片，以70 ℃～72 ℃烤片30～60 min 为宜，脱蜡8 min/3 缸，梯度乙醇3 min/每缸，流水冲洗1 min，蒸馏水中浸泡待用，而后高压修复，蒸馏水清洗后3%过氧化氢室温孵育，蒸馏水清洗干净，PAP 笔画圈，PBS 清洗3 min/3 次，一抗过夜，PBS 缓冲液冲洗，滴加二抗室温孵育15 min，PBS 缓冲液洗3 min/3 次，DAB 现配现用，孵育3～5 min，自来水终止，再HE 复染，盐酸酒精液分化，氨水返蓝，流水冲洗3 min，梯度乙醇脱水，每缸3 min，透明3 min，中性树胶固封。
1.9 统计学处理
所有数据均采用 Prism 9 软件进行分析，以均数±标准差（±s） 表示，多组间比较使用方差分析（ANOVA）。P＜0.05 为差异具有统计学意义。
2.1 逍遥丸活性成分及作用靶点
根据OB≥30% 且DL≥0.18 的标准 ，用TCMSP 数据库进行筛选，得到逍遥丸活性成分122个。其 中 薄 荷9 个，当 归2 个，白 芍6 个，白 术4 个，柴胡11 个，茯苓6 个，甘草82 个，生姜2 个，见表1。
表1 部分中药成分Tab 1 Some components of traditional Chinese medicine
2.2 “中药-活性成分-交集靶点-疾病”网络分析
在 GeneCards 数据库中，获得了OP 靶点1 225个，将有效成分靶点与疾病靶点的交叉点绘制成韦恩图，如图所示1。根据OP 靶点与逍遥丸活性成分的相互作用，采用 Cytoscape 软 件构建 “中药-活性成分-交集靶点-疾病”网络，结果如图2 所示。结果显示逍遥丸中甘草、薄荷、生姜等多种活性成分可调 节 多 个 靶 点，如CAMKMT、GSK3B、PTGS1、ESR1 等，体现了逍遥丸其多靶点、多成分协同调控OP 的作用。
2.3 GO 功能及 KEGG 通路富集分析
在GO 富集分析中，可视化结果如图3 所示，共得到条目 1 358 个，其中包括 25 个CC 条目、85 个MF 条目、1 248 个 BP 条目。根据GO 功能分析结果预测，重点靶点主要与外部刺激的反映、对细胞外刺激的反映、对营养水平的反映等有关。
如图4所示为KEGG 富集分析结果，可富集得到 114 个信号通路，主要包括AGES/RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路和MAPK 信号通路等，提示逍遥丸可通过多条信号通路对绝经后骨质疏松症发挥治疗作用。
2.4 去卵巢小鼠模型建立及评价
2.4.1 摘除卵巢组织 在小鼠背部两侧的双侧纵切口处摘取粉红色卵巢进行HE 染色，如果在显微镜下能清楚地看到初级卵泡、次级卵泡等，则表明卵巢已顺利摘除。结果见图5。
2.4.2 卵巢组织摘除前后 Micro-CT 对比 与Sham 组小鼠相比，Ovx 组小鼠的股骨骨小梁网状结构不完整，骨髓腔部分空虚，骨皮质变薄。Sham组小鼠的股骨骨小梁数量丰富、连续性好、骨髓腔缩小。结果见图6。
2.4.3 卵巢组织摘除前后骨组织结构变化 HE 染色结果显示，在Sham 组小鼠的股骨组织中，骨小梁排列紧密、连续性好、各骨小梁之间缝隙较小、罕见断裂、骨髓腔大小正常。与 Sham 组相比，Ovx 组小鼠的股骨排列稀疏，骨小梁断裂严重，连续性被破坏，骨髓腔明显增大，呈典型骨质疏松改变。结果见图7。
2.5 逍遥丸干预后结果
2.5.1 逍遥丸对小鼠行为学影响 本次试验期间，除OVX 组外，其余小鼠生活习性正常，毛发颜色正常，活动能力强，健康状况良好；
每只小鼠的尿液和粪便在模型实验后一周内恢复正常，未出现小鼠咬伤，创口感染，胃肠道梗阻，缝合线脱落，切口皮肤坏死或小鼠死亡；
灌胃试验中没有出现腹部水肿和喉穿孔；
整个试验期间小鼠的饮食，生活，精神状态均较好。模型组（Ovx 组）易脱毛，毛的颜色变暗，活动度降低，反射变长，排泄增加，进食饮水减少。
2.5.2 药物干预后小鼠影像学指标检测 与Sham组相比，OVX 组小鼠股骨的骨小梁稀疏、断裂、骨皮质变薄。与OVX 组相比，高剂量逍遥丸组小鼠骨小梁少许断裂，网状结构恢复，骨髓腔部分缩小程度明显，而低剂量逍遥丸组虽然有骨小梁增多，骨髓腔缩小，但仍有骨小梁断裂现象；
假手术组骨小梁结构更具连续性和完整性。结果见图8。
2.5.3 药物干预后小鼠病理切片HE 染色 Sham组股骨组织结构致密、为网状结构且排列规则、骨髓腔大小正常且连续性强，邻近骨小梁间的间距相对较小。与Sham 组相比，OVX 组股骨皮质和骨松质均出现缺损，骨小梁减少，间隙变大，连续性中断，结构变稀疏，骨髓腔增宽，骨皮质变薄。逍遥丸（高，低）组组小鼠股骨中骨小梁的结构较模型组基本完好、间距缩小、连接增加，骨髓腔缩小、结构更致密。结果见图9。
2.5.4 药物干预后各组的免疫组化结果 免疫组化的结果显示，ALP，COL-1，IL-6 以及 RAGE 蛋白的表达阳性反应为骨组织上呈棕黄色或者黄色颗粒。在药物干预下，药物组的ALP，COL-1 阳性颗粒表达增多，IL-6，RAGE 阳性颗粒减少。药物组的 ALP 的平均光密度值均高于模型组，逍遥丸（高，低）组有显著性差异（P＜0.05）。药物组的COL-1 的平均光密度值高于模型组，逍遥丸（高，低）组差异具有统计学意义（P＜0.05）。药物组的IL-6 的平均光密度值均低于模型组，逍遥丸（高，低）组的差异具有统计学意义（P＜0.05）。药物组的RAGE 平均光密度均低于模型组，其中，逍遥丸（高，低）组差异具有统计学意义（P＜0.05）。免疫组织化学法检测结果见图10。
图1 逍遥丸-骨质疏松症交集靶点及韦恩图Fig 1 Xiaoyao pill-osteoporosis intersection targets and wayne diagram
图2 逍遥丸治疗骨质疏松症“有效成分 - 作用靶点”网络图Fig 2 Network diagram of "active ingredient-target" of Xiaoyao pill in the treatment of osteoporosis
图3 逍遥丸治疗骨质疏松症作用靶点的 GO 分析Fig 3 GO analysis of the target of Xiaoyao pill in the treatment of osteoporosis
图4 逍遥丸治疗骨质疏松症作用靶点的 KEGG 富集分析Fig 4 KEGG enrichment analysis of Xiaoyao pill in the treatment of osteoporosis
图5 卵巢样本 HE 染色（20×）Fig 5 HE staining of ovarian samples （20×）
图6 Sham 组和Ovx 组小鼠股骨 Micro-CT 扫描结果Fig 6 Micro-CT scan results of femur in Sham and Ovx mice
图7 两组小鼠骨骺端骨组织形态对比（10×）Fig 7 Comparison of epiphyseal bone tissue morphology between two groups of mice （10×）
图8 逍遥丸治疗后各组小鼠股骨显微CT 比较Fig 8 Comparison of femoral micro-CT of mice in each group after Xiaoyao pill treatment
图9 逍遥丸治疗后各组小鼠股骨切片HE 染色结果（10×）Fig 9 HE staining results of femoral sections of mice in each group after Xiaoyao pill treatment （10×）
图10 免疫组织化学法检测逍遥丸对骨质疏松小鼠 AGES/RAGE 信号通路及成骨标记基因蛋白表达的影响（40×）Fig 10 Immunohistochemistry to detect the effect of Xiaoyao pill on the protein expression of AGES/RAGE signaling pathway and osteogenic marker gene in osteoporosis mice （40×）
PMOP 的主要病因为绝经后妇女卵巢功能减退，雌激素减少分泌，骨矿物质密度降低，从而引发了进行性骨流失，这是骨质流失的主要原因，主要发生于中老年女性［7］。
因此，重要的是寻找可以改变或控制的因素以预防骨质疏松症［8］。
中医对本病的病因病机及其治疗研究日渐增多。骨痹的发生与肝有很大的联系［9］。中医理论认为，疏肝理气，舒筋活络，与四肢、肌肉和骨骼的强健密切相关，随着年龄的增长，肝的藏血功能减退，精血生成不足，其次，中老年女性由于癸水耗损，容易出现肝气郁结、阴火损伤，最终导致精血不足，或精血功能低下，骨络失于濡养进而发生PMOP”［10］。提示在 PMOP 发病中，肝脏功能起着非常重要的作用。
传统经典妇科良药逍遥丸以甘草、当归、茯苓、芍药、白术、柴胡等为主要原料，具有疏肝解郁、养血健脾的功效，该方最早收录于宋代《太平惠民和剂局方》。近年有报道称其在体内外均能刺激成骨细胞生成，而成骨细胞是骨的基石，人类骨骼系统生长发育与其活性及数量息息相关，成骨细胞随年龄增加代谢逐渐降低，不敌骨吸收而终形成骨质疏松症。雷霞等［11］发现逍遥丸含药血清对鼠成骨细胞株的增殖有明显促进作用，成骨细胞作为骨形成的最重要的功能单元，其增殖和分化是预防和治疗骨质疏松的重要手段，但其防治PMOP 具体作用机制尚不清楚。ALP 主要表达在骨钙化区域，联合水解酶作用磷酸酯释放钙以沉淀方式附着于胶原骨架上，有利于成骨［12］。骨代谢的微环境是骨基质，其有机成分的90%为Ⅰ型胶原蛋白［13］。本文研究发现，药物组小鼠免疫组化中ALP 及COL-1 蛋白表达水平均高于模型组，说明逍遥丸在改善骨质疏松作用中可通过增加成骨基因指标来实现。有研究发现，逍遥丸含药血清体外可调节成骨细胞的增殖与分化，且成骨细胞的增殖与雌激素受体密不可分［14］。雌激素可通过与雌激素受体结合直接作用于骨组织细胞，推动成骨细胞增殖和分化，促使破骨细胞凋亡并且抑制其活性，从而维持骨吸收与骨形成之间的平衡，保护骨组织［15］。本文研究中，Micro-CT 及HE 染色结果显示去卵巢小鼠在逍遥丸干预后其骨质程度相比于模型组明显得到改善（骨小梁增多、断裂减少、骨髓腔缩小明显），因此推测逍遥丸可能是通过发挥雌激素样骨保护作用增加成骨细胞活性，提高骨质量从而增加ALP、COL-1 等成骨基因表达。
在关于逍遥丸靶向基因与骨质疏松症之间的网络药理学研究中，共发现有114 条 KEGG 通路。在前 30 条KEGG 通路中，按P值递增最高的为AGES/RAGE 信号通路。晚期糖基化终末产物（AGE）是一组通过非酶促反应形成的分子。这些化合物与多种与年龄相关的疾病有关，其中包含骨质疏松症［16］。越来越多的证据表明，AGEs 及其受体 （RAGE） 系统会引发氧化应激，随后在血管壁细胞、成骨细胞和破骨细胞中引起炎症反应，此外，AGEs 在有机骨基质中的交联可能对骨的抗断裂性产生不利影响，说明AGEs 对肌肉骨骼疾病也具有有害作用［17］。据报道，AGEs 会降低破骨细胞和成骨细胞的分化和功能，并抑制胶原的交联活性，导致骨脆性增强［18］，晚期糖基化终产物受体 （RAGE）是免疫球蛋白家族中的一种跨膜蛋白，具有多个配体，并参与许多慢性疾病，例如糖尿病和 OP。
越来越多的证据表明，RAGE 信号的激活会对骨重塑产生负面影响。其配体，如晚期糖基化终产物 （AGEs）、S100、β-淀粉样蛋白 （Aβ） 和高迁移率组盒 1（HMGB1），已被充分证明它们可能负向调节成骨细胞的增殖和分化，并正向刺激破骨细胞生成通过激 活 RAGE 的 表 达［19］。鉴 于 AGES/RAGE 信 号通路在骨重建和成骨细胞分化中的重要作用及网络药理学kegg 富集分析结果，选择AGES/RAGE信号通路在动物实验中进行蛋白检测，揭示防治OP 药物的作用机制，以期为骨质疏松的治疗提供新思路。本文采用免疫组化法检测小鼠股骨切片中AGEs-RAGE 通路中RAGE 蛋白及下游因子IL6 的表达，结果显示药物组小鼠中RAGE 及 IL6蛋白表达水平均低于模型组，说明逍遥丸可通过抑制AGEs-RAGE 通路，阻止其恶性循环，从而促进成骨细胞增殖而预防 OP 发生发展。
通过背部去势法为小鼠摘除双侧卵巢［20］，成功建立绝经后骨质疏松症模型，并且，在逍遥丸的干预下，小鼠骨小梁数量、连接密度均见提高，提示逍遥丸对骨质疏松症有较好的疗效作用。综上所述，本研究通过网络药理学与动物实验证实，绝经后骨质疏松小鼠采用逍遥丸干预后可显著改善骨代谢，增加骨矿含量与骨度，机制可能与抑制 AGEs-RAGE 通路以及增加成骨因子ALP、COL-1 活性相关。本研究为逍遥丸在治疗OP 相关疾病方面的临床应用奠定理论基础和实验依据。
作者贡献度声明：
旷珊珊、赵娜、杨艺欣：对研究的思路或设计有关键贡献并且参与了研究数据的获取分析解释过程，张耀文、解继胜：起草或修改文章关键内容。
所有作者声明不存在利益冲突关系。
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