付婷婷 贾 晖 黄 遂 欧 芳 谢芳芳 周 佩 廖 健
湖南省湘潭市中心医院感染性疾病与肝病科，湖南湘潭 411100
乙型肝炎病毒（hepatitis bvirus，HBV）是常见的传染性疾病，且呈现世界性流行趋势[1]，世界卫生组织提出的2030年病毒性肝炎消除目标中指出，慢性乙型肝炎诊断率应达到90%，治疗率应达到80%，但我国目前的诊断及治疗率仅有22%及15%[2]。有研究指出，中国有约77%的肝硬化和84%的肝癌是由HBV感染所进展而来的[3]，慢性乙型肝炎是HBV感染所致的传染性疾病，严重影响了患者生活质量[4]。因此，需要寻找新的方法提高乙型肝炎诊断率，并及时干预，改善预后。过往研究显示，HBV病情进展与外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）凋亡、免疫耐受有关[5]，程序性死亡受体-1（programmed cell death protein 1，PD-1）属于免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白[6]，在HBV感染过程中，PD-1处于持续活跃状态[7]，半胱氨酸天冬氨酸酶（cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9）属于启动性，介导参与PBMC死亡受体凋亡和线粒体凋亡[8]。所以本研究探究乙型肝炎患者不同阶段的PBMC表面PD-1、Caspase-9水平，寻找其临床表达意义，希望能对不同病情阶段乙型肝炎的诊断提供积极影响并提高乙型肝炎患者的预后。
1.1 一般资料
选取湘潭市中心医院（本院）感染性疾病与肝病科2020年3月至2022年9月进行治疗的224例乙型肝炎患者，根据其病情阶段将其分为乙型肝炎轻度组（n=83）、乙型肝炎中度组（n=76）和乙型肝炎重度组（n=65）。另取同期肝癌患者21例作为肝癌组，同期健康体检人员70例为健康组。乙型肝炎轻度组中男51例（61.45%），女32例（38.55%），年龄33～59岁，平均（43.72±6.27）岁；
乙型肝炎中度组中男46例（60.53%），女30例（39.47%），年龄33～58岁，平均（45.07±5.98）岁；
乙型肝炎重度组中男41例（63.08%），女24例（36.92%），年龄31～56岁，平均（44.69±6.13）岁；
肝癌组中男15例（71.43%），女6例（28.57%），年龄39～65岁，平均（49.22±6.08）岁；
健康组中男44例（62.86%），女26例（37.14%），年龄32～61岁，平均（47.27±6.02）岁。5组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05），具有可比性，见表1，本研究经本院医学伦理委员会批准，并且所有参与本研究的患者均知情同意本研究内容。
表1 5组一般资料比较
1.2 纳入及排除标准
纳入标准：符合《原发性肝癌诊疗规范（2019年版）》[9]中有关乙型肝炎和肝癌的诊断标准；
临床资料完整；
同意并愿意配合本次研究。排除标准：患有其他严重器官及功能障碍或恶性肿瘤的乙型肝炎者；
意识障碍或患有严重精神疾病的乙型肝炎患者；
不同意或不愿意配合本研究内容的乙型肝炎患者；
临床资料不完整的乙型肝炎患者。
1.3 方法
乙型肝炎及肝癌患者在入院次日清晨、健康体检人员在体检日清晨空腹抽取10 ml外周静脉血进行肝功能指标的检测以及PBMC表面PD-1、Caspase-9水平的检测，比较各组乙型肝炎患者肝功能指标，PBMC表面PD-1、Caspase-9水平，统计分析不同病情阶段与PBMC表面PD-1、Caspase-9水平的关系以及其对于病情阶段的预测价值。
1.4 观察指标
1.4.1 肝功能指标 取5 ml静脉血，以3500 r/min的速度在离心机中离心15 min，分离血清后通过全自动生化仪进行谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的检测，通过实时荧光定量PCR法进行乙型肝炎DNA（hepatitis B virus deoxyribonucleic acid，HBV-DNA）的定量检测[10]。
1.4.2 PBMC表面PD-1、Caspase-9水平 取5 ml静脉血，以3500 r/min的速度在离心机中进行15 min的离心，分离血清后通过酶联免疫吸附法进行Caspase-9水平的检测，过程按照试剂盒说明进行，免疫组化染色SP法进行PBMC表面PD-1表达的检测，阳性对照选择已知阳性标本切片，阴性对照选择PBS液替代血清进行检测。
1.4.3 诊断敏感度和特异度 诊断敏感度=真阳性例数/（真阳性+假阴性）例数×100%；
特异度=真阴性例数/（真阴性+假阳性）例数×100%。
1.5 统计学处理
通过双人录入方法保证数据的质量，使用SPSS 23.0统计学软件对所有记录资料进行相关分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用F检验，计数资料用[n（%）]表示，行χ2检验，采用Pearson进行相关性分析，过ROC曲线分析PBMC表面PD-1、Caspase-9水平及联合检测对重度乙型肝炎发展为肝癌的预测价值，确定其曲线下面积（AUC值）、置信区间（95%CI）、截断值、敏感度及特异度，P＜ 0.05为差异有统计学意义。
2.1 5组肝功能指标比较
乙型肝炎轻度组、乙型肝炎中度组、乙型肝炎重度组患者和肝癌患者的AST、ALT、HBV-DNA显著高于健康组，乙型肝炎轻度组、乙型肝炎中度组、乙型肝炎重度组和肝癌组AST、ALT依次升高，并且各组之间差异有统计学意义（P＜ 0.05）。但乙型肝炎轻度组、乙型肝炎中度组、乙型肝炎重度组和肝癌组患者的HBV-DNA差异无统计学意义（P＞ 0.05），见表2。
表2 5组肝功能指标分析（）
表2 5组肝功能指标分析（）
注 与健康组比较，aP ＜ 0.05；
与轻度组比较，bP ＜ 0.05；
与中度组比较，cP ＜ 0.05；
与重度各组比较，dP ＜ 0.05；
AST：谷草转氨酶；
ALT：谷丙转氨酶；
HBV-DNA：乙型肝炎DNA
HBV-DNA（IU/ml）健康组7024.27±3.2726.82±2.011.31±0.31乙型肝炎轻度组8343.47±6.23a114.28±23.27a5.31±0.28a乙型肝炎中度组76112.28±9.19ab134.44±32.09ab5.42±0.31a乙型肝炎重度组65232.18±50.28abc254.28±43.22abc5.46±0.29a肝癌组21408.36±87.29abcd427.15±101.33abcd5.88±0.52a F值52.45289.28132.028 P值＜0.001＜0.001＜0.001组别nAST（U/L）ALT（U/L）
2.2 5组PBMC表面PD-1、Caspase-9水平比较
与健康组比较，乙型肝炎轻度组、乙型肝炎中度组、乙型肝炎重度组和肝癌组患者的PBMC表面PD-1、Caspase-9水平明显升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。乙型肝炎轻度组、乙型肝炎中度组、乙型肝炎重度组和肝癌组Caspase-9水平依次降低，各组之间差异有统计学意义（P＜ 0.05）。乙型肝炎轻度组、乙型肝炎重度组和肝癌组PBMC表面PD-1依次升高，各组差异有统计学意义（P＜ 0.05）；
中度组PD-1和轻度组差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见表3。
表3 5组PBMC表面PD-1、Caspase-9水平比较（）
表3 5组PBMC表面PD-1、Caspase-9水平比较（）
注 与健康组比较，aP ＜ 0.05；
与轻度组比较，bP ＜ 0.05；
与中度组比较，cP ＜ 0.05；
与重度组比较，dP ＜ 0.05；
PBMC：外周血单个核细胞；
PD-1：程序性死亡受体-1；
Caspase-9：半胱氨酸天冬氨酸酶9
组别nPD-1（%）Caspase-9（pmol/L）健康组7025.27±8.218.61±5.22乙型肝炎轻度组8341.38±11.23a397.33±112.37a乙型肝炎中度组7643.47±13.01a312.69±90.71ab乙型肝炎重度组6552.81±13.22abc220.33±83.29abc肝癌组2166.42±15.17abcd152.06±55.37abcd F值62.719102.271 P值＜0.001＜0.001
2.3 肝功能指标和PBMC表面PD-1、Caspase-9水平的相关性
AST、ALT、HBV-DNA与PBMC表面PD-1、Caspase-9水平存在着显著关联（P＜ 0.05），其中PBMC表面PD-1与AST、ALT呈正相关，与HBV-DNA呈负相关，而Caspase-9水平与AST、ALT呈负相关，与HBV-DNA呈正相关，见表4。
表4 肝功能指标和PBMC表面PD-1、Caspase-9水平的相关性
2.4 PBMC表面PD-1、Caspase-9水平对重度乙型肝炎发展为肝癌的预测意义
以肝癌组患者作为阳性样本，乙型肝炎重度组作为阴性样本，绘制ROC曲线分析，结果显示，PBMC表面PD-1、Caspase-9水平以及联合检测的预测价值均较高，其中联合检测的诊断价值最高且其敏感度和特异度均较好，见表5、图1。
图1 PBMC表面PD-1、Caspase-9水平预测肝癌的ROC曲线
表5 PBMC表面PD-1、Caspase-9水平对重度乙型肝炎发展为肝癌的预测意义
本研究发现，与健康组比较，乙型肝炎轻度组、乙型肝炎中度组、乙型肝炎重度组患者和肝癌患者的PBMC表面PD-1、Caspase-9水平都出现了显著上升，PD-1是免疫抑制分子，与细胞凋亡有关，过往研究显示，PD-1与配体结合能够影响HBV特异性T细胞的活化及增殖，干扰细胞表面信号传导，参与HBV感染过程[11-12]，在此过程中，受负向免疫的影响，肝脏组织出现炎症损伤，PBMC表面PD-1表达会出现异常升高[13]，而Caspase-9在PBMC凋亡线粒体途径中有着重要影响，能够对细胞毒性死亡信号进行介导[14]，本研究中还发现，随着病情的严重程度提高，Caspase-9水平逐步下降，可能是由于病情进展之下，肝脏功能恶化，组织出现萎缩病变，PBMC分泌Caspase-9的能力下降[15]。李承幸等[5]也指出随着乙型肝炎病情的进展，Caspase-9水平出现下降趋势，与本研究结果一致。
本研究还发现乙型肝炎患者肝功能指标都出现了显著上升，AST和ALT为肝脏疾病的常用诊断指标，可以反映肝细胞的损伤，而过往研究指出HBV-DNA定量与肝脏组织学变化相关，与本研究结果相似[16]。本研究还发现PBMC表面PD-1与AST、ALT呈正相关，与HBV-DNA呈负相关，而Caspase-9水平与AST、ALT呈负相关，提示PBMC表面PD-1和Caspase-9水平可能对肝损伤进行预测，ROC曲线检测后发现，联合检测AUC值为0.911，说明其预测价值较好。
由于时间及人力等原因的限制，本次仅就一家医院内的患者进行了研究，未来需要多地区多医院的联合研究对结果进行进一步证明，此外本研究虽然指出了PD-1、Caspase-9水平与乙型肝炎不同阶段的相关性，但具体作用机制尚不明确，未来需要更深入的研究进行探讨。
综上所述，乙型肝炎患者不同阶段的PBMC表面PD-1、Caspase-9水平有显著差异，且两者表达水平与肝功能指标存在相关性，进行PD-1、Caspase-9的联合检测可以对重度乙型肝炎发展为肝癌进行预测。
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